B1 as: Категория B1 AS в водительских правах — что это?

не считаются «утерянными» почтовыми перевозчиками в течение 90 дней после отправки.Таким образом, мы не будем считать заказ официально потерянным до истечения этого времени. Мы можем считать заказ потерянным до этой даты на основании информации об отслеживании и нашего предыдущего опыта, но это будет рассматриваться в индивидуальном порядке.

Витамин B1 (тиамин) — PowerOnPowerOff

Чем это известно?

Витамин B1 известен своей ролью в производстве энергии и нервной системе.

Почему мы используем его при включении питания?

Функция №1: Витамин B1 является важным ингредиентом для выработки энергии мозга (АТФ)

Витамин B1 — необходимый ингредиент в рамках цикла Кребса.Основная функция пути Кребса — способствовать выработке аденозинтрифосфата. Затем АТФ служит источником энергии в головном мозге и во всех других клетках тела.

Gibson GE, Blass JP. Питание и функциональная нейрохимия. В: Siegel GJ, Agranoff BW, Albers RW и др., Редакторы. Основы нейрохимии: молекулярные, клеточные и медицинские аспекты. 6-е издание. Филадельфия: Липпинкотт-Рэйвен; 1999.

Осиезага К., Али С., Фриман С. и др. Дефицит тиамина и делирий.Инновации в клинической неврологии. 2013; 10 (4): 26-32.

Функция № 2: Витамин B1 участвует в производстве нейромедиаторов как часть пентозофосфатного пути

Пентозофосфатный путь — это путь, который происходит в различных частях человеческого тела (включая мозг). Тиамин является необходимым кофактором в пентозофосфатном пути, и его участие приводит к образованию ряда важных молекулярных продуктов, включая нейротрансмиттеры. Нарушение участия тиамина в этом процессе может привести к повреждению нервных клеток.

Kennedy DO. Витамины группы В и мозг: механизмы, доза и эффективность — обзор. Питательные вещества. 2016; 8 (2): 68. DOI: 10.3390 / nu8020068.

Kruger N, von Schaewen A. Окислительный пентозофосфатный путь: структура и организация. Текущее мнение в биологии растений. 2003; 6 (3): 236-246. DOI: 10,1016 / s1369-5266 (03) 00039-6

Осиезага К., Али С., Фриман С. и др. Дефицит тиамина и делирий. Инновации в клинической неврологии. 2013; 10 (4): 26-32.

Gibson GE, Blass JP.Питание и функциональная нейрохимия. В: Siegel GJ, Agranoff BW, Albers RW и др., Редакторы. Основы нейрохимии: молекулярные, клеточные и медицинские аспекты. 6-е издание. Филадельфия: Липпинкотт-Рэйвен; 1999.

Функция №3: Витамин B1 участвует в модуляции нейромедиатора ацетилхолина

Тиамин важен для здоровья нервной системы из-за его роли в синтезе ацетилхолина, важного нейромедиатора. Роль тиамина в его синтезе заключается в качестве кофактора с ацетил-КоА для производства ацетилхолина.Ацетилхолин, в свою очередь, является нейромедиатором, который стимулирует мышечный контроль и поведение. Он также является передатчиком в области мозга и необходим для памяти и познания.

Purves D, Augustine GJ, Fitzpatrick D, et al., Редакторы. Неврология. 2-е издание. Сандерленд (Массачусетс): Sinauer Associates; 2001. Ацетилхолин. Доступно по ссылке: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK11143/

Хирш Дж, Парротт Дж. Новые взгляды на нейромодулирующую роль тиамина. Фармакология.2012; 89 (1-2): 111-116. DOI: 10,1159 / 000336339.

Kennedy DO. Витамины группы В и мозг: механизмы, доза и эффективность — обзор. Питательные вещества. 2016; 8 (2): 68. DOI: 10.3390 / nu8020068.

Почему именно эта форма?

В то время как дефицит тиамина в Соединенных Штатах чрезвычайно редок, появляются новые исследования, показывающие более высокий уровень дефицита тиамина среди людей, страдающих ожирением. Тиамин имеет высокую всасываемость.

Находится в:

Орехи, семечки, говяжья печень, свинина, курица, индейка, бобовые, горох и зародыши пшеницы

B1 как Network Forensics | CloudCover

Сетевой криминалистический анализ (NFA) требует реконструктивного анализа трафика. Для этого криминалистическая экспертиза сети NFA требует менее секундного мониторинга и захвата. В любом случае скорость и объем данных требуют автоматизации. Существует два основных метода сетевой криминалистики; «Поймай как сможешь» и «остановись-посмотри-послушай». Первый захватывает и сохраняет все пакеты, проходящие через сеть. Это потребует очень большой емкости хранения и механизма быстрого поиска. Метод «стоп-просмотр-прослушивание» анализирует каждый пакет и сохраняет только ключевые компоненты. Таким образом, механизмы хранения и быстрого поиска не должны быть такими большими или быстрыми.

Инструменты сетевой экспертизы должны выполнять три задачи. Во-первых, он должен захватывать сетевой трафик, во-вторых, он должен анализировать трафик в соответствии с потребностями пользователя, и в-третьих, он должен использовать какую-либо форму инструмента обнаружения, чтобы найти полезные и интересные компоненты сохраняемого трафика.

Анализ трафика потребует возможности обнаружения и захвата обычного трафика, включая зашифрованный трафик всех протоколов.Затем сопоставьте этот трафик со всеми портами и протоколами. Примеры включают возможность автоматического переключения со стандартного порта на нестандартный порт или, если злоумышленник обнаруживает монитор трафика, он может принять дополнительные меры и начать шифрование. Затем вы должны иметь возможность захватывать информацию о полезной нагрузке, которая может быть найдена в других пакетах. Наконец, нужно уметь соотносить отдельные связи, но корреляцию между собой. Это дает возможность исследовать и понимать данные, которые были непонятны на уровне анализатора пакетов.Сетевая криминалистика должна фиксировать это поведение и поддерживать его целостность.

Сетевая экспертиза может генерировать чрезвычайно большой объем данных. Вся суть сетевой криминалистики состоит в том, чтобы уменьшить большой объем данных до полезной информации. Поиск должен учитывать определенный набор и аномальные наборы данных. Таким образом, возможность поиска и видимость являются ключевыми факторами независимо от трафика.

Продукты питания, преимущества и симптомы дефицита

Витамин B1, тиамин или тиамин позволяет организму использовать углеводы в качестве энергии.Он необходим для метаболизма глюкозы и играет ключевую роль в работе нервов, мышц и сердца.

Витамин B1 — это водорастворимый витамин, как и все витамины комплекса B.

Витамины классифицируются в соответствии с материалами, в которых они растворяются. Некоторые растворяются в воде, а другие растворяются в жире. Водорастворимые витамины переносятся с кровотоком. Все, что организм не использует, выводится с мочой.

Витамин B1 в высоких концентрациях содержится во внешних слоях и зародышах злаков, а также в дрожжах, говядине, свинине, орехах, цельнозерновых и бобовых.

Фрукты и овощи, содержащие его, включают цветную капусту, печень, апельсины, яйца, картофель, спаржу и капусту.

Другие источники включают пивные дрожжи и мелассу.

Сухие завтраки и продукты, приготовленные из белой муки или белого риса, могут быть обогащены витамином B.

В Соединенных Штатах люди потребляют около половины своего количества витамина B1 в продуктах, которые естественным образом содержат тиамин, а остальная часть поступает из продуктов, которые содержат тиамин. обогащены витамином.

Нагревание, приготовление и обработка пищевых продуктов, а также их кипячение в воде разрушают тиамин. Поскольку витамин B1 растворим в воде, он растворяется в воде для приготовления пищи. Белый рис, который не обогащен, будет содержать только одну десятую тиамина, доступного в коричневом рисе.

Управление диетических добавок (ОРВ) Национального института здравоохранения (NIH) отмечает, что одна порция обогащенных хлопьев для завтрака содержит 1,5 миллиграмма (мг) тиамина, что составляет более 100 процентов от рекомендуемой дневной нормы.

Один ломтик цельнозернового хлеба содержит 0,1 мг, или 7 процентов дневной нормы. Сыр, курица и яблоки не содержат тиамина.

Людям необходим постоянный запас витамина B1, потому что он не хранится в организме. Он должен быть частью ежедневного рациона.

Витамин B1 или тиамин помогает предотвратить осложнения в нервной системе, мозге, мышцах, сердце, желудке и кишечнике. Он также участвует в потоке электролитов в мышечные и нервные клетки и из них.

Помогает предотвратить такие заболевания, как бери-бери, при заболеваниях сердца, нервов и пищеварительной системы.

Применение в медицине

Пациенты, которые могут получать тиамин для лечения низкого уровня витамина B1, включают пациентов с периферическим невритом, который представляет собой воспаление нервов вне мозга, или пеллагру.

Люди с язвенным колитом, стойкой диареей и плохим аппетитом также могут получать тиамин. Тем, кто находится в коме, могут делать уколы тиамина.

Некоторые спортсмены используют тиамин, чтобы улучшить свои результаты. Это не запрещенные вещества для спортсменов в США.

Другие условия, при которых добавки тиамина могут помочь, включают:

Не все из этих видов применения были окончательно подтверждены исследованиями.

Дефицит витамина B1 обычно приводит к бери-бери, состоянию, которое проявляется проблемами с периферическими нервами и истощением.

Возможны потеря веса и анорексия.

Могут быть психические проблемы, включая спутанность сознания и кратковременную потерю памяти.

Мышцы могут стать слабыми, и могут появиться сердечно-сосудистые симптомы, например увеличение сердца.

Сколько витамина B1 нам нужно?

В США рекомендуемая суточная норма тиамина, принимаемого внутрь, составляет 1,2 мг для мужчин и 1,1 мг для женщин старше 18 лет. Беременным или кормящим женщинам любого возраста следует принимать 1,4 мг в день.

Кто подвержен риску дефицита B1?

Люди с плохим питанием, раком, «утренним недомоганием» во время беременности, бариатрическими операциями и гемодиализом подвержены риску дефицита тиамина.

Люди, которые регулярно злоупотребляют алкоголем, могут иметь дефицит, поскольку они не могут усваивать тиамин из своей пищи.

Синдром Вернике-Корсакова — это заболевание, поражающее людей с хроническим алкоголизмом. Это связано с недостатком тиамина и может быть смертельным, если не лечить.

Люди с синдромом Вернике-Корсакова и те, кто отказывается от алкоголя, могут получать инъекции тиамина, чтобы помочь им выздороветь.

Другие заболевания, такие как ВИЧ, могут снижать усвоение питательных веществ, и это может привести к дефициту витамина B1.

Все витамины группы B водорастворимы. Они помогают преобразовывать углеводы, жиры и белок в энергию или глюкозу.

Витамины группы В необходимы для поддержания здоровья печени, кожи, волос и глаз. Они также играют роль в нервной системе и необходимы для нормальной работы мозга.

Витамины группы B иногда называют антистрессовыми витаминами, поскольку они укрепляют иммунную систему организма во время стресса.

Доказательства не подтверждают вред от слишком большого количества витамина B1, но U.S. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) предупреждает об использовании добавок.

Они призывают людей проконсультироваться со своим лечащим врачом, прежде чем использовать добавки с пищевыми продуктами или вместо них, и призывают общественность обращаться за советом к врачу о том, как улучшить свое здоровье, а не ставить себе диагноз.

Взаимодействия

Чай и кофе содержат дубильные вещества, химические вещества, которые могут взаимодействовать с тиамином, что затрудняет его усвоение.

Некоторые химические вещества в сырых моллюсках и рыбе могут разрушать тиамин, что может привести к его дефициту при употреблении в больших количествах. Приготовление пищи разрушает эти химические вещества, но также разрушает тиамин.

Идентификация рецептора скавенджера B1 как рецептора микроскладчатых клеток дыхательных путей для Mycobacterium tuberculosis

Существенные изменения:

1) Добавьте следующие элементы управления к показанным данным:

A) Генетическая комплементация любого из штаммов Mtb, у которых отсутствуют гены T7SS.

Мы благодарим рецензента за то, что он подчеркнул необходимость дополнения, которое исторически использовалось для контроля полярных эффектов или мутаций вне мишени.В нашей рукописи мы решили использовать два независимых мутанта, каждый из которых имеет нефункциональный T7SS, так как маловероятно, что оба штамма будут иметь схожие нецелевые эффекты введенных генетических модификаций, помимо известного широкого воздействия на T7SS, закодированного в Локус RD1 или оба могут иметь спонтанные мутации в других областях генома. Кроме того, оба штамма, которые мы использовали в этом исследовании, MtbΔ esxA (Stanley et al. , 2007) и Mtb eccD1 :: Tn5370 (Stanley et al., 2007; Stanley et al., 2003) были изучены ранее, в том числе с комплементацией активности T7SS (т.е. секрецией EsxA), что исключает полярные эффекты и основные геномные изменения у исходных мутантов. Чтобы подтвердить отсутствие дополнительных мутаций, которые могли возникнуть во время лабораторного пассажа, мы секвенировали геномы всех трех штаммов: Mtb Erdman, Mtb ErdmanΔ esxA и Mtb Erdman eccD1 :: Tn5370 и сравнили их с опубликованными данными Mtb Erdman. эталонный геном (GenBank: AP012340).Полное секвенирование генома выявило ожидаемую делецию в esxA наряду с присутствием остаточных последовательностей транспозона и кассеты гигромицина, использованных при генерации мутанта (Mtb esxA в эталонном геноме — ERDMAN_RS20430, а делеция расположена в NC_020559. 1: 4333535-4333786) и вставка транспозона в eccD1 (Mtb eccD1 в эталонном геноме — ERDMAN_RS20440, а вставка — в NC_020559.1: 4337340). Как и ожидалось, все три штамма имели незначительные отличия от эталонного генома, и, что важно, Mtb Erdman WT и Mtb eccD1 :: Tn5370 были идентичны друг другу.Когда мы сравнивали Mtb Erdman WT с Mtb Erdman Δ esxA, , мы обнаружили только один вариант кодирования, кодирующий миссенс-мутацию в Mtb Erdman Δ esxA , по сравнению с Mtb Erdman WT в предполагаемой оксидоредуктазе. Мы загрузили данные о секвенировании в архив чтения последовательностей (№ подачи SRA PRJNA605439) и включили таблицу вариантов в дополнительный материал (дополнительный файл 1).

B) Добавьте EsxB в качестве контрольного белка для Фигуры 2 D-H.

Этот эксперимент теперь отражен на исправленном Рисунке 2D-H.

C) Добавьте неинфицированные контрольные данные трансвелл на рисунок 1G.

У нас не было неинфицированных данных для добавления, но мы включили данные о транслокации для контрольных трансвеллеров, не культивированных совместно с клетками Raji-B, в новые рисунки 1H и 1I.

D) Добавьте контроль загрузки и белок EsxA, извлеченный для вестерн-блоттинга на Фигуре 3B.

Мы добавили элемент управления загрузкой, как было предложено. Для раскрывающегося списка EsxA мы попытались обнаружить EsxA после анализа переключения биотина, но не смогли обнаружить белок ни с моноклональным антителом EsxA, ни с антителом против His.Не исключено, что реакция затронула эпитопы, обнаруживаемые антителами.

Кроме того, правильно ли указаны маркеры молекулярной массы для этого рисунка и есть ли другие размеры маркеров? Негликозилированный SR-BI действительно составляет ~ 55-57 кДа, однако, судя по маркерам, в этом блоте это не так. Кроме того, полностью гликозилированный SR-BI не должен превышать 82 кДа. Таким образом, гликозилирование следует подтверждать обработкой EndoH. Также возможно, что полоса при 130 кДа может представлять олигомер SR-BI, но это следует проверить, поскольку расчетная молекулярная масса не совпадает с молекулярной массой димера SR-BI. Проверяли ли авторы, действительно ли эта полоса 130 кДа потенциально связана с SR-BI с другим белком?

Мы благодарим рецензента за определение проблемы, связанной с молекулярной массой SR-B1. Что касается расхождения молекулярной массы SR-B1 (130 кДа против 82 кДа), мы вернулись к нашим данным вестерн-блоттинга / IP и обнаружили, что причиной расхождения было основное антитело, которое мы использовали для обнаружения SR-B1. В проведенном эксперименте мы использовали поликлональные антикроличьи антитела против SR-B1 (Novus Biologicals NB400-104), которые по неясным причинам продемонстрировали SR-B1 на ~ 130 кДа как в наших руках, так и на веб-сайте продукта.Когда мы использовали моноклональные антитела мыши против SR-B1, которые чаще используются в полевых условиях (abcam; ab52629), мы продемонстрировали SR-B1 с ожидаемой молекулярной массой 82 кДа (см. Изображение ответа автора 1). Теперь мы переделали анализ переключения биотина с использованием моноклонального антитела ab52629, получили соответствующий размер для SR-B1 и соответственно изменили рисунок (новый рисунок 3B).

2) Пожалуйста, добавьте следующую недостающую информацию / данные:

A) Гели кумасси очистки EsxA и EsxB и обсуждение любого контроля качества, выполняемого для белков, например MS-анализа, для подтверждения идентичности / чистоты.

Гель кумасси теперь входит в дополнительные материалы (новый рисунок 2 — приложение к рисунку 1).

B) Методы анализа ЖХ-МС.

Подробные методы ЖХ-МС теперь включены в раздел «Материалы и методы».

C) Для всех микроскопических изображений, пожалуйста, укажите, сколько всего изображений представляют собой представленные в рукописи. (т.е. сколько полей зрения было отображено за один независимый эксперимент?).

В зависимости от эксперимента, от 3 до 5 полей для каждого условия отображались и количественно оценивались. Эта информация добавлена ​​в раздел «Материалы и методы».

D) Количественная оценка совместной локализации EsxA и SRB-1 на Рисунке 4.

Количественное определение представлено на рисунке 4F.

E) На рисунке 1B показано около 10 бактерий в поле, но график в C показывает 100–150 площади бактерий на поле. Отличается ли площадь бактерий от количества бактерий? Как были получены числа, изображенные на графике?

Мы благодарим рецензента за выделение этого запутанного момента.Изображение на Рисунке 1B представляет собой репрезентативное изображение с большим увеличением, но не всего поля. Первоначально мы решили количественно определить количество бактерий с помощью ImageJ, чтобы определить интенсивность пикселей на поле в качестве объективного суррогата для ручного подсчета бактерий. Для ясности мы изменили анализ так, чтобы количество бактерий на 100 клеток было определено количественно в исправленной рукописи.

F) На рис. 2E и 3D показано аналогичное количество ядер в поле, но на рис. 2D показаны ядра, по крайней мере, в два раза выше, чем 3C.Как эти числа определяются / рассчитываются?

Как и выше, представленные изображения являются репрезентативными изображениями, а не изображениями поля в целом. Количество ядер в поле подсчитывали с помощью ImageJ.

G) Для рисунка 1B и других авторы должны представить изображение в светлом поле, чтобы определить, где должны быть границы клеток, чтобы попытаться различить прилипшие бактерии или внутри клеток-хозяев.

Несмотря на то, что мы понимаем беспокойство рецензента, на светлых изображениях невозможно различить прикрепленные и усвоенные бактерии.Для этого потребуется конфокальная микроскопия с Z-образными стеками, а такие эксперименты довольно сложны для трансвеллеров. Поскольку нас интересовало связывание с клетками, которое могло включать поверхностное связывание и впоследствии интернализованные бактерии, мы не проводили дополнительных экспериментов.

H) На фиг. 3 обогащение пептидов APOE и SRB1 с помощью EsxA IP значительно меньше, чем обогащение рецептора трансферрина и трансферрина. Сколько или каждый «рецептор» вы снизили относительно количества EsxA и трансферрина? Является ли график вулкана результатом одной, двух или трех независимых копий из IP?

Рецептор трансферрина — это повсеместно экспрессируемый и обильный белок клеточной поверхности, поэтому компания Dualsystems Biotech, с которой мы заключили контракт, предоставляет трансферрин в качестве положительного (экспериментального) контроля.Мы представляем данные трансферрина / рецептора трансферрина только для демонстрации успеха анализа TriCEPS, а не для сравнительных целей. Кроме того, с помощью этого метода невозможно количественно оценить количество каждого рецептора. Сюжет вулкана является результатом одного эксперимента с тремя независимыми биологическими повторами. Последний пункт теперь четко поясняется в легенде к рисунку 3A.

I) Можно ли включить схему трансвеллентного анализа на рис. 1?

Добавлен на рисунок 1 как новый рисунок 1B.

J) Для рисунка 4: должна быть указана молекулярная масса полосы SR-BI. Доступна ли более низкая экспозиция этого иммуноблота?

Молекулярная масса была добавлена, и изображение с более низкой экспозицией теперь заменяет рисунок 3B.

3) Файлы данных и версии статистики:

A) Необходимо предоставить полный файл данных протеомики, подтверждающий график вулкана на рисунке 3A.

Полный файл данных протеомики был добавлен в качестве дополнительных данных (новый дополнительный файл 2).

B) Следует добавить статистические методы, которые привели к p-значениям, используемым для построения графика вулкана на рисунке 3A.

Добавлен в раздел «Материалы и методы» согласно предложению.

C) Неясно, подходит ли t-критерий Стьюдента во всем. Например, я думаю, что t-тест подходит для сравнения обработанных и необработанных (как RajiB против контроля для одного штамма), но не подходит для сравнения двух штаммов или белков (например, 1C-E и 2A, C).

Для всей рукописи мы заменили t-критерий Стьюдента на односторонний дисперсионный анализ с поправками на множественные сравнения, поскольку это более строгий инструмент статистического анализа. С этим изменением были обновлены материалы и методы, а также условные обозначения фигур.

D) Укажите, следует ли считать, что условия, не указанные на рисунках, существенно не отличаются друг от друга, или добавьте дополнительную таблицу результатов всех статистических сравнений.Например, было бы интересно узнать, существенно ли отличаются друг от друга deccD +/- RajiB в 1С и 1Е.

Мы добавили комментарий к легенде для каждого рисунка, где это уместно, показывая, что если сравнения не выделены напрямую, они не являются статистически значимыми.

4) Добавьте следующие исправления, связанные с ссылками:

A) Следует использовать правильный справочник по гликозилированию SR-BI (подраздел «Рецептор скавенджера класса B типа 1 связывает EsxA и экспрессируется на М-клетках in vitro») (более старые статьи Кригера).

Спасибо за предложение. Мы отредактировали этот раздел, чтобы отразить новые данные (см. Комментарий 1D выше) и включить исходную статью Acton et al. чтобы указать правильный MW.

B) «Двумя наиболее распространенными белками, секретируемыми T7SS, являются EsxA и EsxB» — добавьте ссылку.

Спасибо за предложение. Мы включили ссылки, подробно описывающие распространенность этих двух белков.

C) Обсуждение, абзац четыре — укажите, пожалуйста, что Shen et al.это обзор. В противном случае предоставьте исходную ссылку для идентификации SR-BI как рецептора ЛПВП.

Мы изменили ссылку, чтобы указать исходную идентификацию SR-B1 как рецептора HDL.

Некоторые другие моменты, которые необходимо учитывать, чтобы укрепить сделанные выводы:

1) Что нужно учитывать — возможно ли выполнение прямого IP между EsxA и растворимыми доменами SRB-1? Это подтверждает вывод о том, что SRB1 является «рецептором» EsxA и что взаимодействие между ними является прямым.В качестве альтернативы, если используемый вами анализ перекрестной сшивки демонстрирует прямое взаимодействие между EsxA и SRB1, несмотря на то, что это происходит от лизатов, это необходимо четко указать и обсудить.

Спасибо за предложение. Выполнение IP EsxA с растворимым доменом SR-B1 будет проблемой, поскольку неизвестно, являются ли трехмерные структуры растворимого (т.е. рекомбинантного) и трансмембранного SR-B1 одинаковыми, и, следовательно, растворимый SR-B1 может не совпадать. связывают EsxA по техническим, а не биологическим причинам.Мы провели два независимых анализа с использованием EsxA для исследования связывания с клеточной поверхностью. Хотя оба включали стадию перекрестного связывания (TriCEP и биотиновый переключатель), они также оба выполнялись на целых клетках, а не на лизатах, и оба продемонстрировали взаимодействие между EsxA и SR-B1.

2) Открытия авторов поднимают вопрос о том, может ли химическое ингибирование SR-B1 ингибировать связывание EsxA и транслокацию Mtb. Использование химического ингибитора SR-B1 снимет любые опасения, что генетический нокдаун SR-B1 влияет на биологию М-клеток в целом.Химический ингибитор также можно использовать in vivo.

Спасибо за предложение. Хотя мы признаем, что это важный эксперимент, мы обеспокоены тем, что ингибитор активности SR-B1, который блокирует интернализацию HDL (например, установленный ингибитор интернализации HDL BLT-1), может не обладать такой же ингибирующей активностью для связывания / интернализации Mtb. Таким образом, интерпретируемым может быть только положительный результат (т.е. ингибитор успешно предотвращает интернализацию Mtb). Кроме того, введение такого ингибитора in vivo может привести к противоречивым результатам, поскольку оно может не только влиять на интернализацию М-клеток, но также на интернализацию, опосредованную макрофагами SR-B1.

3) Можно ли выделить первичные М-клетки от мышей SR-BI ^{— / —} , чтобы окончательно идентифицировать SR-BI как рецептор EsxA? Это повысило бы значимость этих исследований.

SR-B1 ^{— / —} Мышей практически невозможно разводить, они имеют множественные отклонения в развитии и физиологические отклонения. Текущая работа в лаборатории сосредоточена на разработке мыши Cre, специфичной для М-клеток, которая позволит осуществить условную делецию SR-B1 из М-клеток, специфичную для определенного типа клеток, путем скрещивания с мышью SR-B1 ^{fl / fl} .Однако проверка и тестирование экспрессии Cre, скрещивание этих мышей с последующим тестированием их на активность М-клеток выходит за рамки данной рукописи.

4) В рукописи есть несколько данных, которые указывают на то, что EsxA может быть не единственным фактором или что на М-клетках могут быть дополнительные рецепторы для EsxA. Например, рисунок 4: все еще есть ячейки EsxA + в отсутствие SRB1. Кроме того, транслокация в М-клетки выше для гранул с EsxA, чем для Mtb? Означает ли это, что на поверхности Mtb могут присутствовать дополнительные факторы, модулирующие этот процесс? У М.tb без esxA по-прежнему перемещаются на низком уровне, что снова указывает на дополнительные факторы? Эта возможность должна быть четко рассмотрена в Обсуждении.

Спасибо, что подняли эти важные вопросы. Мы расширили обсуждение, чтобы включить идею о том, что на М-клетках могут быть дополнительные рецепторы EsxA, и что другие факторы Mtb также могут опосредовать проникновение в М-клетки.

Артикул:

Стэнли, С.А., Джондроу, Дж. Э., Мансанильо, П., Кокс, Дж. С. 2007. Ответ IFN типа I на инфекцию Mycobacterium tuberculosis требует секреции, опосредованной ESX-1, и вносит свой вклад в патогенез. J Immunol 178 : 3143–3152.

Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин B1 как новый маркер раннего обнаружения рака легких человека

Аннотация

Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин (hnRNP) A2 / B1 — это РНК-связывающий белок, необходимый для созревания предшественника мРНК. Tockman et al. ранее сообщал, что hnRNP A2 / B1 с M _r из 31000 сверхэкспрессируется на ранней клинической стадии рака легких человека (M.S. Tockman et al. , J. Clin. Онкол., 6: 1685–1693, 1988). Однако, когда мРНК hnRNP A2 / B1 и hnRNP B1 были изучены отдельно, мы обнаружили уникальное свидетельство того, что hnRNP B1 мРНК, который является сплайсинговым вариантом мРНК hnRNP A2 , был более значительно повышен при раке легких. тканей, чем мРНК hnRNP A2 / B1 . Наше hnRNP B1-специфическое поликлональное антитело специфически распознало белок hnRNP B1 как ядерный белок M _r 37000 с помощью вестерн-блоттинга, но не распознало белок hnRNP A2. Иммуногистохимическое окрашивание антителом hnRNP B1 показало, что белок hnRNP B1 специфически окрашивался в ядрах человеческих раковых клеток и, в частности, в плоскоклеточных карциномах, но не в ядрах нормальных соседних эпителиальных клеток легких. Мы считаем, что белок hnRNP B1 M _r 37000, а не hnRNP A2, хорошо подходит в качестве биомаркера для выявления рака легких у человека.

Введение

В Японии рак легких является основной причиной смерти от рака среди мужчин (20.9%) и вторая ведущая причина среди женщин (11,9%) (1) . Общая выживаемость составляет всего 40% через 5 лет, в основном из-за рецидива заболевания или возникновения второго первичного рака даже среди пациентов с полностью удаленным раком. (2) . Для ранней клинической диагностики рака легких были исследованы различные опухолевые маркеры, такие как прогастрин-высвобождающий пептид и нейрон-специфическая энолаза для мелкоклеточного рака легкого, а также карцино-эмбриональный антиген, SCC. 3 антиген, для немелкоклеточного рака легкого (3, 4, 5, 6) .Однако биомаркер, который может надежно обнаружить рак легких на очень ранней стадии, еще не подтвержден.

В 1988 г. Tockman et al. впервые сообщил, что специфическое для рака легких моноклональное антитело 703 D распознает белок hnRNP A2 / B1 человека с M _r , равным 31000, и что белок hnRNP A2 / B1 часто сверхэкспрессируется на ранней клинической стадии первичной немелкоклеточный рак легкого (7) . Кроме того, они сообщили, что hnRNP A2 / B1 сильно экспрессируется в эпителиальных клетках бронхов по данным цитологического исследования мокроты до диагностики рака легких с помощью рентгеновских снимков. (7, 8, 9, 10) .Эти результаты показали, что белок hnRNP A2 / B1 может быть полезным инструментом для раннего выявления рака легких у человека.

hnRNP A2 / B1 является основным компонентом корового комплекса hnRNP в ядрах клеток млекопитающих. Хотя функция hnRNP A2 / B1 еще полностью не выяснена, недавние исследования показали, что hnRNP A2 / B1 участвует в сплайсинге РНК в ядрах, а также в транспорте мРНК из ядра в цитоплазму. (11 , 12) .

Один из наших авторов (Т.К.) ранее выяснены (13) полная последовательность человеческого гена hnRNP A2 / B1 . Она обнаружила, что мРНК hnRNP B1 представляет собой вариант сплайсинга мРНК hnRNP A2 , и что белок hnRNP B1 содержит дополнительные 12 аминокислот, которых нет в белке hnRNP A2, с прогнозируемым M _r из 37000 для белка hnRNP B1. и 34000 для белка hnRNP A2. На основании доказательств того, что мРНК hnRNP B1 составляет 2–5% от мРНК hnRNP A2 / B1 (13) , мы исследовали экспрессию мРНК hnRNP A2 / B1 и hnRNP B1 отдельно.Мы обнаружили, что мРНК hnRNP B1 более специфично повышена в клетках рака легких человека, чем мРНК hnRNP A2 / B1 . Далее мы получили hnRNP B1-специфическое антитело и использовали его для разработки специфического и чувствительного иммуногистохимического метода обнаружения рака легких человека. Это первое сообщение о том, что hnRNP B1 хорошо квалифицирован как новый онкомаркер рака легких человека, что предполагает, что наши анти-hnRNP B1-специфические антитела будут полезны для ранней диагностики рака легких.

Материалы и методы

Рак легких и клеточные линии человека.

Все виды рака легких, использованные в этом исследовании, были взяты у пациентов, перенесших операцию в 1997 году в больнице онкологического центра Сайтама. Удаленные раковые и доброкачественные ткани отдельно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до проведения экстракции РНК. Ткани, фиксированные формалином и залитые парафином, использовали для последующего иммуногистохимического анализа.Использовали следующие клеточные линии рака легких человека: ( a ) A549 (аденокарцинома) из банка клеток RIKEN, Япония; и ( b ) h326B (SCC), SK-MES (SCC), H596 (аденосквамозно-клеточная карцинома) и ChaGo K-1 (SCC) от доктора Джонатана Кури из Онкологического центра М. Д. Андерсона Техасского университета, Хьюстон, Техас.

ОТ-ПЦР.

Общая РНК была выделена из злокачественных и доброкачественных тканей методом экстракции кислотным гуанидином / фенолом / хлороформом, как сообщалось ранее. (14) .Один мкг тотальной РНК наносили на RT с обратной транскриптазой MuLV (Roche Molecular Systems, Нью-Джерси) при 37 ° C в течение 60 мин. Полученные кДНК (1 мкг) амплифицировали с использованием праймеров, специфичных для hnRNP A2 / B1 и hnRNP B1, в следующих условиях: ( a ) начальная денатурация при 95 ° C в течение 5 мин; и ( b ) 25-цикловая амплификация для hnRNP A2 / B1 или 28-цикловая для hnRNP B1. Продукты ПЦР подвергали 5% -ному PAGE в 0,5-кратном буфере трисборной кислоты-ЭДТА. Радиоактивность продуктов ПЦР определяли с помощью анализатора BAS 2000 Bioimage (Fuji Photo Film Co.Ltd., Токио, Япония). После нормализации на количество мРНК β- актина в качестве контроля экспрессию мРНК hnRNP A2 / B1 и мРНК hnRNP B1 в раковой ткани сравнивали с экспрессией в соседней доброкачественной ткани. Результаты были получены в двойных анализах.

Получение антител против hnRNP A2 / B1 и анти-hnRNP B1.

Антитела против hnRNP A2 / B1 и анти-hnRNP B1 были получены у кроликов с использованием 18-мерного синтетического пептида (аминокислотные остатки 194–210 + цистеин) для белка hnRNP A2 / B1 и 19-мерного синтетического пептида (аминокислотные остатки 3 –20 + цистеин) для белка hnRNP B1. Иммунизированные сыворотки очищали аффинно антигеном, а затем очищали колоночной хроматографией Mono-Q.

Вестерн-блоттинг и иммуногистохимия.

Клеточные линии рака легких человека поддерживали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FCS. Для приготовления цитозольной и ядерной фракций клетки лизировали в буфере 2- (N-морфолино) этансульфоновой кислоты (pH 7,0), содержащем 17 мМ 2- (N-морфолино) этансульфоновую кислоту, 20 мМ ЭДТА, 250 мМ сахарозы. 50 мкг / мл лейпептина, 300 мкг / мл апротинина и 1 мМ фенилметансульфонилфторид.Супернатант получали в виде цитозольной фракции центрифугированием при 100000 × g в течение 60 мин при 4 ° C. Ядра обрабатывали ультразвуком в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% Твин 20, 50 мкг / мл лейпептина, 300 мкг / мл апротинина и 1 мМ фенилметансульфонилфторид, и центрифугировали при 15000 × г в течение 20 мин при 4 ° С. Супернатант использовали как ядерную фракцию. Цитозольные и ядерные фракции подвергали SDS-PAGE. Вестерн-блоттинг выполняли с использованием антител против hnRNP A2 / B1 и против hnRNP B1, а белок hnRNP A2 / B1 визуализировали с помощью системы усиленной хемилюминесценции (Amersham Pharmacia Biotech, Бакингемшир, Великобритания).Иммуногистохимическое окрашивание проводили стандартным методом, как сообщалось ранее. (15) . Вкратце, депарафинизированный срез ткани толщиной 5 мкм нагревали в микроволновой печи в течение 5 минут дважды, а затем обрабатывали антителами против hnRNP A2 / B1 и hnRNP B1 в течение ночи при 10 ° C после визуализации с помощью системы DAKO ENVISSION (DAKO Co Карпинтерия, Калифорния). Иммуногистохимическое исследование было проведено двумя независимыми исследователями (Е.С. и Ю.Г.).

Результаты и обсуждение

Повышение уровня мРНК

Сначала мы определили уровень мРНК hnRNP A2 / B1 и hnRNP B1 в общей РНК, выделенной из раковой ( T ) и доброкачественной ткани ( N ) шести пациентов с помощью ОТ-ПЦР, используя их специфические праймеры. Как на рис.1 A ⇓ показывает, что мРНК hnRNP A2 / B1 одинаково экспрессировалась в злокачественных и доброкачественных тканях шести пациентов. Однако мы обнаружили, что экспрессия мРНК hnRNP B1 была специфически повышена в злокачественных тканях всех шести пациентов по сравнению с уровнями в доброкачественных тканях.Увеличение было от 1,5 до 4 раз (рис. 1 B ) ⇓ . Когда уровни мРНК hnRNP были нормализованы мРНК β- актина , мРНК hnRNP B1 была увеличена в 0,5–2,5 раза, чем мРНК hnRNP A2 / B1 в раковых тканях шести пациентов.

Повышение уровня мРНК hnRNP B1 в ткани рака легких человека. В A общая РНК была выделена из раковых ( T ) и доброкачественных ( N ) тканей пациентов с первичным раком легкого, как описано в разделе «Материалы и методы.Уровни мРНК hnRNP B1 и hnRNP A2 / B1 отдельно определяли методом ОТ-ПЦР с использованием наборов специфических праймеров для hnRNP B1 и hnRNP A2 / B1 . В B сравнительную экспрессию мРНК hnRNP B1 в раковых ( T ) и доброкачественных тканях ( N ) определяли после нормализации на количество мРНК β- актина в качестве контроля.

Zhou et al. (9) также сообщили, что мРНК hnRNP A2 / B1 была сверхэкспрессирована в клетках рака легких человека.Однако мы демонстрируем здесь первое свидетельство того, что мРНК hnRNP B1 , а не hnRNP A2 / B1 мРНК, специфически повышена при раке легких человека по сравнению с ее уровнями в доброкачественной прилегающей ткани. Поскольку мРНК hnRNP B1 составляет 2–5% от мРНК hnRNP A2 / B1 , наше открытие повышенной экспрессии мРНК hnRNP B1 является важным подтверждением открытия группы Токмана.

Иммуногистохимическое определение белков hnRNP A2 / B1 и hnRNP B1.

Для определения экспрессии белков hnRNP A2 / B1 и hnRNP B1 в клетках рака легких человека мы использовали поликлональные антитела против hnRNP A2 / B1 и против hnRNP B1. Антитело против hnRNP A2 / B1 распознало две полосы белка с M _r из 37000 и 34000 в ядерной фракции клеток линии клеток аденокарциномы A549, но не в цитозольной фракции. Молярное соотношение M _r 37000 и 34000 белков сравнимо с мРНК hnRNP B1 к hnRNP A2 / B1 мРНК.Поскольку антитело против hnRNP B1 значительно обнаружило один белок M _r 37000 в ядерной фракции (рис. 2 A ) ⇓ , мы пришли к выводу, что белок M _r 37000 является hnRNP B1, а белок M _r 34000 — hnRNP A2. Преиммунная нормальная кроличья сыворотка не реагировала с этими двумя белками.

Иммуногистохимическое определение белков hnRNP A2 / B1 и hnRNP B1. Ядерную ( N ) и цитозольную ( C ) фракции клеток выделяли, как описано в разделе «Материалы и методы.Вестерн-блоттинг выполняли с использованием антител против hnRNP A2 / B1 и против hnRNP B1. В A экспрессия белков hnRNP A2 / B1 и hnRNP B1 в клетках A549 была обнаружена с помощью антител против hnRNP A2 / B1 и против hnRNP B1. B , экспрессия белка hnRNP B1 в пяти клеточных линиях рака легких человека. Стрелки указывают M _r hnRNP B1 (37 000) и hnRNP A2 (34 000).

Сообщалось, что белок hnRNP A2 / B1 сверхэкспрессируется в клетках рака легких человека. (7, 8, 9, 10) .Мы проанализировали экспрессию белка hnRNP B1 в различных клеточных линиях рака легких человека, и результаты с пятью исследованными линиями клеток рака легких человека (одна аденокарцинома, одна аденосквамозная карцинома и три плоскоклеточной карциномы) показали, что уровни экспрессии hnRNP B1 белка варьировали (рис. 2 B ) ⇓ . Таблица 1 ⇓ показывает, что экспрессия мРНК hnRNP B1, и белка относительно хорошо коррелированы между всеми клеточными линиями, кроме SK-MES.Чтобы определить последствия экспрессии hnRNP B1, мы изучили время удвоения этих клеточных линий (скорость роста клеток). Как Таблица 1 ⇓ показывает, что линии клеток с быстрым ростом, такие как A549 и h326B, экспрессировали высокие количества белка hnRNP B1, тогда как линии клеток с медленным ростом, такие как H596 или ChaGo K-1, экспрессировали меньшие количества. Первоначально предполагалось, что белок hnRNP A2 / B1 участвует в сплайсинге РНК, транспорте мРНК и регуляции транскрипции. (10 , 11 , 16) . Кроме того, недавнее исследование показало, что белок hnRNP A2 / B1 связывается с теломерной последовательностью ДНК. (17 , 18) .Вопрос о том, как сверхэкспрессия белка hnRNP B1 в раковых клетках влияет на нарушение регуляции клеточных функций, требует дальнейшего изучения.

Экспрессия белка hnRNP B1, связанная со скоростью роста клеток различных линий клеток рака легких человека

Сверхэкспрессия белка hnRNP B1 в раковых клетках, но не в нормальных эпителиальных клетках легкого человека.

Первичный рак и соседние доброкачественные ткани, полученные от 43 больных раком легкого, были подвергнуты иммуногистохимическому исследованию с использованием антител против hnRNP A2 / B1 и против hnRNP B1. Рис. 3 ⇓ показывает, что экспрессия hnRNP B1 была обнаружена только в ядрах раковых клеток, а не в ядрах нормальной прилегающей ткани, такой как нормальные эпителиальные клетки бронхов и альвеолярные эпителиальные клетки (фиг. 3, A и C ) ⇓ .

Сверхэкспрессия белка hnRNP B1 в раковых клетках, но не в нормальных эпителиальных клетках легкого человека. Иммуногистохимическое окрашивание злокачественных и доброкачественных тканей проводили с использованием антител против hnRNP B1 и анти-hnRNP A2 / B1 соответственно.Сверхэкспрессия белка hnRNP B1 наблюдалась в ядре раковых клеток ( A ), но не в нормальных эпителиальных клетках бронхов ( C ). Отрицательное окрашивание антителом против hnRNP A2 / B1 ( B ) в том же гистологическом срезе, что и ( A ). D , окрашивание H&E того же среза, что и ( A ) и ( C ). Контр-окрашивание проводили гематоксилином.

Затем мы проанализировали специфичность и чувствительность антитела против hnRNP B1 для обнаружения клеток рака легких по сравнению с результатами, полученными с использованием антитела против hnRNP A2 / B1. Антитело против hnRNP A2 / B1 показало положительный тканевый ответ у 22 (55%) из 43 пациентов с тотальным раком легкого и у 8 (53%) из 15 пациентов с SCC. Примечательно, что сверхэкспрессия белка hnRNP B1, окрашенного антителом против hnRNP B1, наблюдалась у 32 (74%) из 43 больных раком, включая уникальное открытие — всех пациентов с SCC. Кроме того, 12 из 43 были больными раком стадии I и в каждом отдельном случае показали положительное окрашивание раковой ткани антителом hnRNP B1.

Вместе взятые, наши результаты показывают, что белок hnRNP B1 сверхэкспрессируется на ранней стадии развития рака легкого человека и, следовательно, является полезным маркером для раннего выявления рака легкого человека, особенно для SCC.Таким образом, мы считаем, что белок hnRNP B1 является более специфичным и чувствительным маркером рака легких, чем белок hnRNP A2 / B1. До сих пор неясно, как наша система анализа распознала гиперэкспрессию белка hnRNP B1 по сравнению с белком hnRNP A2, поскольку белок hnRNP B1 идентичен белку hnRNP A2, за исключением 12 дополнительных аминокислот в hnRNP B1. (13) . Об этом сообщалось ранее (19) что hnRNP представляет собой комплекс примерно из 30 основных белков с M _r в диапазоне от 30 000 до 120 000, и что эти белки фосфорилируются казеинкиназой 2 и связываются с кальмодулином (20) .Белок hnRNP B1 является более основным, чем белок hnRNP A2 (20) потому что его NH ₂ -концевой дополнительный пептид содержит кластер основных аминокислот. По этой причине мы считаем, что белок hnRNP B1 легче распознается своим антителом, чем белок hnRNP A2. В настоящее время ожидается, что антитело против hnRNP B1 будет использоваться при исследовании образцов мокроты во время скрининга населения на рак легких.

Благодарности

Мы благодарим Dr.Джонатану Кури из Онкологического центра им. М. Д. Андерсона Техасского университета (Хьюстон, Техас) за предоставление клеточных линий рака легких человека; Доктора Эйдзу Цучия, Кадзунори Нисида и Ёсио Токучи за щедрое сотрудничество; и доктору Ясухито Кобаяши за техническую поддержку.

Сноски

• Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Таким образом, данная статья должна быть помечена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для указания этого факта.

• №1 Эта работа была частично поддержана грантами на исследования рака, Специальное исследование рака Министерства образования, науки, спорта и культуры Японии; грант Министерства здравоохранения и социального обеспечения на реализацию второй всеобъемлющей 10-летней стратегии борьбы с раком, Япония; и гранты Фонда содействия исследованиям рака, Фонда исследований курения, Мемориального фонда наук о жизни Уэхара, Мемориального фонда Сузукена и Фонда исследований растений факультета сельского хозяйства Киотского университета.

• №2 Кому следует обращаться с запросами на перепечатку, в Исследовательском институте онкологического центра Сайтамы, Ина, Китаадачи-гун, Сайтама 362-0806, Япония. Эл. Почта: hfuji {at} saitama-cc.go.jp

• ↵3 Используемые сокращения: SCC, плоскоклеточная карцинома; hnRNP, гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин; RT, обратная транскрипция.

• Поступила 26 января 1999 г.
• Принята 15 февраля 1999 г.

• © 1999 Американская ассоциация исследований рака.

Каталожные номера

1. ↵

   Департамент статистики и информации Министерства здравоохранения и социального обеспечения. . Статистика естественного движения населения Японии в 1995 году, Министерство здравоохранения и социального обеспечения Токио 1995.

2. ↵

   Комитет по регистрации рака легких. Временные тенденции и выживаемость при раке легких Ватанабэ С. Томинага С. Какидзоэ Т. ред.. Монография Ганна по исследованию рака 43, : 119-127, Japan Scientific Society Press, Токио 1995.

3. ↵

   Miyake Y., Kodama T., Yamaguchi K. Прогастрин-высвобождающий пептид (31–98) является специфическим онкомаркером у пациентов с мелкоклеточной карциномой легких. Cancer Res., 54 : 2136-2140, г. 1994.

4. ↵

   Прадос М. К., Альварес-Сала Р., Бласко Р., Чивато Т., Сатуэ Дж. Л. Г., Рио Ф. Дж. Дж., Де Террерос Ф. Дж. Дж., Вилламор Дж. Клиническое значение нейрон-специфической енолазы как онкомаркера в бронхоальвеолярном лаваже. Рак (Phila.), 74 : 1552-1555, г. 1994.

5. ↵

   Конканнон Дж. П., Далбоу М. Х., Либлер Г. А., Блейк К. Э., Вейл С. С., Купер Дж. У. Анализ карциноэмбрионального антигена при бронхогенной карциноме. Рак (Phila.), 34 : 184-192, г. 1974.

6. ↵

   Мино Н. , Иио А., Хамамото К. Доступность опухолевого антигена 4 как маркера плоскоклеточного рака легкого и других органов. Рак (Phila.), 62 : 730-734, 1988.

7. ↵

   Tockman MS, Gupta PK, Myers JD, Frost JK, Baylin SB, Gold EB, Chase AM, Wilkinson PH, Mulshine JL Распознавание чувствительных и специфических моноклональных антител антигена рака легких человека на консервированных клетках мокроты: новый подход к раннему лечению легких обнаружение рака.J. Clin. Онкол., 6 : 1685–1693, г. 1988.

8. ↵

   Чжоу Дж., Дженсен С. М., Стейнберг С. М., Мулшин Дж. Л., Линнойла Р. I. Экспрессия маркера раннего обнаружения рака легкого p31 в неопластическом и неопухолевом респираторном эпителии. Рак легких (Лимерик), 14 : 85-97, 1996.

9. ↵

   Чжоу Дж., Мулшин Дж. Л., Ансуорт Э. Дж., Скотт Ф. М., Авис И. М., Вос М.Д., Трестон А. М. Очистка и характеристика белка, позволяющего раннее обнаружение рака легких. J. Biol. Chem., 271 : 10760-10766, г. 1996.

10. ↵

    Токман М. С., Мулшин Дж. Л., Пиантадози С., Эрозан Ю. С., Гупта П. К., Ракдешель Дж. К., Тейлор П. Р., Жуков Т., Чжоу В.-Х., Цяо И.-Л., Яо С.-Х. Перспективное выявление доклинического рака легких: результаты двух исследований гиперэкспрессии гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина A2 / B1.Clin. Cancer Res., 3 : 2237-2246, г. 1997.

11. ↵

    Майеда А., Манро С. Х., Касерес Дж. Ф., Крайнер А. Р. Функция консервативных доменов hnRNP A1 и других белков hnRNP A / B. EMBO J., 13 : 5483-5495, г. 1994.

12. ↵

    Nakielny S., Fischer U., Michael W. M., Dreyfuss G. Транспорт РНК. Анну. Rev. Neurosci., 20 : 269-301, 1997.

13. ↵

    Козу Т. , Хенрих Б., Шеффер К. П. Структура и экспрессия гена ( HNRPA2B1, ), кодирующего человеческий белок hnRNP A2 / B1. Геномика, 25 : 365-371, г. 1995.

14. ↵

    Хомчинский П., Сакки Н. Одностадийный метод выделения РНК кислотной экстракцией тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния. Анальный. Биохим., 162 : 156-159, г. 1987.

15. ↵

    Витарелли Э., Сиппелли Г., Туккари Г., Баррези Г. Использование микроволнового излучения для иммуногистохимии: новое методологическое предложение. Histol. Histopathol., 10 : 35-38, 1995.

16. ↵

    Гамильтон Б. Дж., Бернс К. М., Николс Р. С., Ригби В. Ф. С. Модуляция связывания элемента ответа AUUUA гетерогенным ядерным рибонуклеопротеином А1 в Т-лимфоцитах человека: роли цитоплазматической локализации, транскрипции и фосфорилирования. Дж.Биол. Chem., 272 : 28732-28741, г. 1997.

17. ↵

    McKay S.J., Cooke H. hnRNP A2 / B1 специфически связывается с однонитевым теломерным повтором позвоночных TTAGGG _n . Nucleic Acids Res., 20 : 6461-6464, г. 1992.

18. ↵

    Ишикава Ф., Матунис М. Дж., Дрейфус Г., Чех Т. Р. Ядерные белки, которые связывают пре-мРНК 3′-последовательность сайта сплайсинга r (UUAG / G) и последовательность теломерной ДНК человека d (TTAGGG) n.Мол. Cell. Биол., 13 : 4301-4310, г. 1993.

19. ↵

    Дрейфус Г., Матунис М. Дж., Пинол-Рома С., Берд С. Г. Белки hnRNP и биогенез мРНК. Анну. Rev. Biochem., 62 : 289-321, г. 1993.

20. ↵

    Bosser R., Faura M., Serratosa J., Renau-Piqueras J., Pruschy M., Bachs O. Фосфорилирование гетерогенных ядерных рибонуклеопротеидов A2 и C печени крысы может модулироваться кальмодулином. Мол. Cell. Биол., 15 : 661-670, 1995.

Бифункциональное действие эфрина-B1 как репеллента и аттрактанта для контроля двунаправленного разгибания ветвей при дорсально-вентральном ретинотопном картировании

Резюме

Мы сообщаем, что лиганд рецептора EphB, эфрин-B1, может действовать бифункционально. как репеллент ветвей и аттрактант для управления уникальными механизмами в картирование дорсально-вентральной (DV) оси сетчатки вдоль латерально-медиального (LM) ось тектума зрительного нерва.Рецепторы EphB экспрессируются в диапазоне DV от низкого до высокого. градиентом ганглиозных клеток сетчатки (RGC), а эфрин-B1 экспрессируется в низком до высокого градиента LM в тектуме. Аксоны RGC не упорядочивают DV вдоль LM. тектальная ось, но направленно простираются интерстициальные ветви, которые устанавливают беседки, заказанные ретинотопом. Недавние исследования показывают, что эфрин-B1 действует как аттрактант в картировании DV и в управлении расширением направленной ветви. Моделирование показывает, что для правильного отображения DV требуется, чтобы этот аттрактант активность взаимодействует с репеллентной активностью в градиенте, имитирующем эфрин-B1.Мы показываем, что эктопические домены высокой ступенчатой ​​экспрессии эфрина-B1 созданные ретровирусной трансфекцией отталкивают интерстициальные ветви аксонов RGC и перенаправляют их расширение вдоль тектальной оси LM, в сторону от их собственно зоны терминирования (ТЗ). Напротив, первичные аксоны RGC не затронуты и проходят через эктопические домены эфрина-B1 и ветвятся в топографически правильный сайт. Однако, когда местоположение ТЗ совпадает с эктопическими доменами эфрина-B1 эти домены, по-видимому, ингибируют ветвление и сформировать разводку беседок.Наши результаты показывают, что эфрин-B1 выборочно контролирует, посредством притяжения или отталкивания, направленное расширение и ветвление интерстициальных ветвей, расширенных аксонами RGC возникающие из той же позиции DV: ветви, которые возникают из расположенных аксонов сбоку от правильной TZ привлекаются градиент эфрина-B1 и ветви, которые возникают из аксонов, расположенных медиальнее той же TZ, отталкиваются вниз по градиенту эфрина-B1.