Разное

Коэффициент по осаго: Коэффициенты ОСАГО в 2021 году на bip.ru

alexxlab 04.06.1975 Нет комментариев

Содержание

Коэффициенты ОСАГО и формула расчета страховой премии ОСАГО

Именно коэффициенты ОСАГО влияют на размер страховой премии. Они рассчитываются индивидуально для водителя или действуют в пределах целого региона.

Именно коэффициенты ОСАГО влияют на размер страховой премии. Они рассчитываются индивидуально для водителя или действуют в пределах целого региона. При этом сами страховые компании на законодательном уровне не могут завышать или занижать стоимость страховки.

Для расчета ОСАГО коэффициенты в 2017 году используются следующие:

  • ТБ – базовый тариф;
  • КТ – территориальный коэффициент;
  • КБМ – коэффициент бонус-малус;
  • КВС – коэффициент возраст-стаж;
  • КО – ограничивающий коэффициент;
  • КМ – коэффициент мощности двигателя;
  • КС – коэффициент сезонности;
  • КН – коэффициент нарушений;
  • КП – коэффициент срока страхования.

Все значения подставляются в формулу: П = ТБ * КТ * КБМ * КВС * КО * КМ * КС * КН * КП.

Следует сразу отметить, что дороже всего обойдется покупка полиса новичкам, проживающим в крупных городах. Но чем дальше от мегаполиса и чем опытней будет водитель, тем меньше для него размер страховой премии.

Базовый тариф

В самом начале формулы ставится базовый тариф, который затем умножается на все коэффициенты. Он строго прописан в законах и страховые компании не могут его менять. Свой тариф присваивается каждому виду транспорта – легковым и грузовым машинам, троллейбусам, автобусам и так далее.

Также на размер базового тарифа влияет цель использования автомобиля. Он повышается для транспорта, принадлежащего юридическому лицу, и становится еще выше, если машина применяется в качестве такси.

Территориальный коэффициент

Рассчитать коэффициент для ОСАГО можно по территории проживания. Чем больше город – тем он выше. Его показатель варьируется в пределах от 1,5 до 2. Например, коэффициент в Москве составляет 2, а в области – 1,7.

Применяемый коэффициент выбирается по месту регистрации физического или юридического лица.

Класс водителя

КБМ присваивается водителю за безаварийную езду. Он хранится в специальной базе, поэтому остается даже при смене страховой компании. Каждый год, прошедший без ДТП, водителю дается 5% скидки от стоимости страхования. Максимальный размер дисконта – 50%.

Если же произошла авария по вине застрахованного лица, то класс снижается. Минимальная категория «М» не только не дает скидки, но и устанавливает коэффициент 2,45. Это существенно повышает стоимость страхования.

Стаж водителя

Чтобы рассчитать ОСАГО по коэффициентам, необходимо учитывать возраст и опыт водителя. Если машиной будет управлять лицо до 22 лет или со стажем менее 3 лет, то страховая премия будет умножена на 1,8.

Для водителей с большим опытом и возрастом коэффициент составляет 1.

Ограничивающий коэффициент

Не применяется ограничивающий коэффициент, если в ОСАГО вписано до 5 лиц. При использовании неограниченного полиса он возрастает до 1,8.

Поэтому, если вы хотите платить за страховку меньше, стоит подумать о строгом ограничении количества лиц, допущенных до управления транспортным средством.

Коэффициент мощности двигателя

Коэффициент мощности двигателя зависит от количества лошадиных сил. Действуют следующие коэффициенты:

  • до 50 л. с. – 0,6;
  • 50−70 л. с. – 1;
  • 70−100 л. с. – 1,1;
  • 100−120 л. с. – 1,2;
  • 120−150 л. с. – 1,4;
  • выше 150 л. с. – 1,6.

Чем мощнее автомобиль, тем дороже обойдется ОСАГО.

Коэффициент сезонности

Снизить размер страховой премии можно, если заключить договор на небольшой срок. Подходит для сезонного использования автомобиля. Минимально можно застраховаться на 3 месяца, действовать при этом будет коэффициент 0,5. Полная стоимость начинается с 10 месяцев страхования.

Коэффициент нарушений

Размер страховой премии повышается, если водитель умышленно способствовал нарушению ДТП, управлял автомобилем в состоянии алкогольного опьянения, покинул место ДТП или управлял машиной без полиса. В результате коэффициент становится 1,5.

Коэффициент срока страхования

Применяется только при движении транспорта транзитом или для иностранных граждан. Может составлять 0,2 при оформлении на срок до 15 дней и повышаться до 1, если страхование делается на 10 и более месяцев.

Чтобы получить точный размер страховой премии, нужно рассчитать ОСАГО с коэффициентами, учитывая свои показатели как водителя и характеристики автомобиля.

Правда и мифы о деньгах в OK

Подписаться

Статья была полезной?

52 8

Комментировать

методика, коэффициенты и рекомендации для выгодной покупки ОСАГО

Территория преимущественного использования транспортного средства: Коэффициент для транспортных средств, за исключением тракторов, самоходных дорожно-строительных и иных машин и прицепов к ним Территориальный коэффициент для тракторов, самоходных дорожно-строительных и иных машин и прицепов к ним
для юридических лиц – место регистрации транспортного средства;
для физических лиц – место жительства собственника транспортного средства
Алтайский край
Барнаул 1,7 1
Бийск 1,2 0,8
Заринск, Новоалтайск, Рубцовск 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Амурская область
Благовещенск 1,6 0,8
Белогорск, Свободный 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1 0,5
Архангельская область
Архангельск 1,8 1
Северодвинск 1,7 1
Котлас 1,6 1
Прочие города и населенные пункты 0,85 0,5
Астраханская область
Астрахань 1,4 1
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Белгородская область
Белгород 1,3 0,8
Губкин, Старый Оскол 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Брянская область
Брянск 1,5 1
Клинцы 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Владимирская область
Владимир 1,6 1
Муром 1,2 0,8
Гусь-Хрустальный 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1 0,8
Волгоградская область
Волгоград 1,3 0,8
Волжский 1,1 0,8
Камышин, Михайловка 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Вологодская область
Череповец 1,8 1
Вологда 1,7 1
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Воронежская область
Воронеж 1,5 1
Борисоглебск, Лиски, Россошь 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Еврейская автономная область
Биробиджан 0,6 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Забайкальский край
Чита 0,7 0,8
Краснокаменск 0,6 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Ивановская область
Иваново
1,8		 1
Кинешма 1,1 0,8
Шуя 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Иркутская область
Иркутск 1,7 1
Шелехов 1,3 0,8
Ангарск 1,2 0,8
Усолье-Сибирское 1,1 0,8
Братск, Тулун, Усть-Илимск, Усть-Кут, Черемхово 1
0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Кабардино-Балкарская Республика
Нальчик, Прохладный 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Калининградская область
Калининград 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Калужская область
Обнинск 1,3
0,8
Калуга 1,2 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Камчатский край
Петропавловск-Камчатский 1,3 0,8
Прочие города и населенные пункты 1 0,5
Карачаево-Черкесская Республика
  1 0,8
Кемеровская область
Кемерово 1,9
1
Новокузнецк 1,8 1
Белово, Березовский, Осинники, Прокопьевск, Междуреченск 1,3 0,8
Анжеро-Судженск, Киселевск, Юрга 1,2 0,8
Прочие города и населенные пункты 1,1 0,8
Кировская область
Киров 1,4 1
Кирово-Чепецк 1,2 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8
0,5
Костромская область
Кострома 1,3 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Краснодарский край
Краснодар, Новороссийск 1,8 1
Анапа, Геленджик 1,3 0,8
Армавир, Сочи, Туапсе 1,2 0,8
Белореченск, Ейск, Кропоткин, Крымск, Курганинск, Лабинск, Славянск-на-Кубани, Тимашевск, Тихорецк 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1 0,8
Красноярский край
Красноярск 1,8 1
Железногорск, Норильск 1,3 0,8
Ачинск, Зеленогорск 1,1 0,8
Канск, Лесосибирск, Минусинск, Назарово 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Курганская область
Курган 1,4 0,8
Шадринск 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Курская область
Курск 1,2 0,8
Железногорск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Ленинградская область
  1,3 1
Липецкая область
Липецк 1,5
1
Елец 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Магаданская область
Магадан 0,7 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Московская область
  1,7 1
Москва
  2 1,2
Мурманская область
Мурманск 2,1 1
Североморск 1,6 0,8
Апатиты, Мончегорск 1,3 0,8
Прочие города и населенные пункты 1,2 0,8
Ненецкий автономный округ
  0,8 0,5
Нижегородская область
Нижний Новгород 1,8 1
Балахна, Бор, Дзержинск 1,3 0,8
Кстово 1,2 0,8
Арзамас, Выкса, Саров 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1 0,8
Новгородская область
Великий Новгород 1,3 0,8
Боровичи 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Новосибирская область
Новосибирск 1,7 1
Бердск 1,3 0,8
Искитим 1,2 0,8
Куйбышев 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Омская область
Омск 1,6 1
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Оренбургская область
Оренбург 1,7 1
Орск 1,1 0,8
Бугуруслан, Бузулук, Новотроицк 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Орловская область
Орел 1,2 0,8
Ливны, Мценск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Пензенская область
Пенза 1,4 1
Заречный 1,2 0,8
Кузнецк 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Пермский край
Пермь 2 1,2
Березники, Краснокамск 1,3 0,8
Соликамск 1,2 0,8
Лысьва, Чайковский 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1,1 0,8
Приморский край
Владивосток 1,4 1
Арсеньев, Артем, Находка, Спасск-Дальний, Уссурийск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Псковская область
Псков 1,2 0,8
Великие Луки 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Республика Адыгея
  1,3 0,8
Республика Алтай
Горно-Алтайск 1,3 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Республика Башкортостан
Уфа 1,8 1
Стерлитамак, Туймазы 1,3 0,8
Благовещенск, Октябрьский 1,2 0,8
Ишимбай, Кумертау, Салават 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1 0,8
Республика Бурятия
Улан-Удэ 1,3 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Республика Дагестан
Буйнакск, Дербент, Каспийск, Махачкала, Хасавюрт 0,7 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Республика Ингушетия
Малгобек 0,8 0,8
Назрань 0,6 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Йошкар-Ола 1,4 0,5
Республика Калмыкия
Элиста 1,3 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Республика Карелия
Петрозаводск 1,3 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Республика Коми
Сыктывкар 1,6 1
Ухта 1,3 0,8
Прочие города и населенные пункты 1 0,8
Республика Марий Эл
Йошкар-Ола 1,3 0,8
Волжск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Республика Мордовия
Саранск 1,5 0,8
Рузаевка 1,2 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Республика Саха (Якутия)
Якутск 1,2 1,2
Нерюнгри 0,8 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Республика Северная Осетия — Алания
Владикавказ 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Республика Татарстан
Казань 2 1,2
Набережные Челны 1,7 1
Альметьевск, Зеленодольск, Нижнекамск 1,3 0,8
Елабуга 1,2 0,8
Бугульма, Лениногорск, Чистополь 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1,1 0,8
Республика Тыва
Кызыл 0,6 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Республика Хакасия
Абакан, Саяногорск, Черногорск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,6 0,5
Ростовская область
Ростов-на-Дону 1,8 1
Батайск 1,3 0,8
Азов 1,2 0,8
Шахты 1,1 0,8
Волгодонск, Гуково, Каменск-Шахтинский, Новочеркасск, Новошахтинск, Сальск, Таганрог 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Рязанская область
Рязань 1,4 1
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Самарская область
Самара 1,6 1
Тольятти 1,5 1
Чапаевск 1,2 0,8
Новокуйбышевск, Сызрань 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Санкт-Петербург
  1,8 1
Саратовская область
Саратов 1,6 1
Энгельс 1,2 0,8
Балаково, Балашов, Вольск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Сахалинская область
Южно-Сахалинск 1,5 1
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Свердловская область
Екатеринбург 1,8 1
Березовский, Верхняя Пышма, Новоуральск, Первоуральск 1,3 0,8
Верхняя Салда, Полевской 1,2 0,8
Асбест, Ревда 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1 0,8
Смоленская область
Смоленск 1,2 0,8
Вязьма, Рославль, Сафоново, Ярцево 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Ставропольский край
Кисловодск, Михайловск, Ставрополь 1,2 0,8
Буденновск, Георгиевск, Ессентуки, Минеральные воды, Невинномысск, Пятигорск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,7 0,5
Тамбовская область
Тамбов 1,2 0,8
Мичуринск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Тверская область
Тверь 1,5 1
Вышний Волочек, Кимры, Ржев 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Томская область
Томск 1,6 1
Северск 1,2 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Тульская область
Тула 1,5 1
Узловая, Щекино 1,2 0,8
Алексин, Ефремов, Новомосковск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Тюменская область
Тюмень 2 1,2
Тобольск 1,3 0,8
Прочие города и населенные пункты 1,1 0,8
Удмуртская Республика
Ижевск 1,6 1
Воткинск 1,1 0,8
Глазов, Сарапул 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Ульяновская область
Ульяновск 1,5 1
Димитровград 1,2 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Хабаровский край
Хабаровск 1,7 1
Комсомольск-на-Амуре 1,3 0,8
Амурск 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Ханты-Мансийский автономный округ
Сургут 2 1,2
Нижневартовск 1,8 1
Ханты-Мансийск 1,5 1
Нефтеюганск, Нягань 1,3 0,8
Когалым 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1,1 0,8
Челябинская область
Челябинск 2,1 1,2
Магнитогорск 1,8 1
Копейск 1,6 1
Златоуст, Миасс 1,4 0,8
Сатка, Чебаркуль 1,2 0,8
Прочие города и населенные пункты 1 0,8
Чеченская Республика
  0,6 0,5
Чувашская Республика
Чебоксары 1,7 1
Новочебоксарск 1,2 0,8
Канаш 1,1 0,8
Прочие города и населенные пункты 0,8 0,5
Чукотский автономный округ
  0,6 0,5
Ямало-Ненецкий автономный округ
Ноябрьск 1,7 1
Новый Уренгой 1 0,8
Прочие города и населенные пункты 1,1 0,8
Ярославская область
Ярославль 1,5 1
Прочие города и населенные пункты 0,9 0,5
Байконур
Байконур 0,6 1

Территориальный коэффициент ОСАГО снизится в городах Дальнего Востока

Снижение территориального коэффициента по ОСАГО ожидается в более чем 180 населенных пунктах по всей России. К такому выводу пришли в Российском союзе автостраховщиков (РСА), проанализировав проект указания Банка России касательно тарифов на ОСАГО. 24 августа в силу вступили поправки к закону об ОСАГО, благодаря которым изменились правила тарификации обязательной автогражданки, сделав её более индивидуализированной. В Якутске ожидается понижение на 1,67%, передаёт ЯСИА.

«Ожидания по снижению региональных коэффициентов вполне оправданы. В первую очередь это снизит нагрузку на систему в целом и будет способствовать уменьшению стоимости полиса, что положительно скажется на настроениях автовладельцев, – уверен директор Института региональных проблем Дмитрий Журавлев. – Конечно, совсем убрать коэффициент можно будет ещё совсем не скоро, но и его уменьшение очень важно. Страна ведь у нас очень разная. Нельзя сравнивать водителей из мегаполисов, и, к примеру, станиц. У них ведь условия дорожные совершенно непохожи. Однако максимально сглаживать коэффициент необходимо, за саму возможность ездить люди должны платить максимальную равную цену. Думаю, на каком-то историческом этапе мы должны достигнуть одинаковой цены и убрать региональный коэффициент».

Однако снижение территориальных коэффициентов ОСАГО можно связать не только с последними изменениями в законе об ОСАГО. На размеры коэффициентов может влиять ситуация с обязательной автогражданкой в конкретном регионе и даже населенном пункте.

«Возможно, что в каком-то конкретном регионе убыточность в среднем высокая, однако в самом областном центре она низкая, что позволяет сократить тариф. Следует обратить внимание, что снижение будет затрагивать в первую очередь крупные города, в которых тарифы ОСАГО были достаточно высоки. Изменения, вводимые в рамках процесса либерализации ОСАГО, не приведут ни к понижению, ни к повышению тарифа в среднем по региону. Тарифы в первую очередь будут меняться в соответствии с тем, какова будет убыточность в отдельны регионах, – отмечает Андрей Крупнов. – Последние изменения, благодаря введению новых коэффициентов, учитывающих индивидуальные особенности автовладельцев, позволят более дифференцированно подходить к тарификации отдельных водителей, таким образом, вырастет разница в величине премии наиболее и наименее рисковых водителей. До сих пор тарификация ОСАГО проводилась по очень усреднённым параметрам, таким как стаж или возраст водителя, а ещё хуже – характеристикам автомобиля. Новые правила позволят рассчитывать тариф на основе тех факторов, которые действительно влияют на уровень риска».

Редакция проекта «ОСАГО – общественная экспертиза» напоминает, что ранее место жительства страхователя играло важную роль в числе факторов, составляющих цену полиса ОСАГО. После вступления в силу поправок к закону об ОСАГО стоимость обязательной автогражданки существенно снизится для аккуратных водителей. Так автомобилисты во многом смогут сами влиять на стоимость страховки.

«24 августа вступили в силу поправки к закону об ОСАГО, благодаря которым тарифы стали более справедливыми: они будут зависеть от индивидуальных параметров автовладельца, влияющих на степень его аварийности. А, например, от территории, на которой он проживает, их зависимость, напротив, снизится», – отметил президент РСА Игорь Юргенс.

Понижающий коэффициент ОСАГО: виды, расчет, базовый коэффициент

Стоимость страхового полиса обязательного страхования строго регламентируется законодательством РФ, что собственно и является основным отличием от иных видов страхования. Изменение стоимости ОСАГО вне регламентированных границ наказывается законом. Сегодня стоимость страхования вполне можно рассчитать самостоятельно, если знать значения повышающих и понижающих коэффициентов, из которых и складывается итоговая стоимость ОСАГО. Однако, производя расчет, следует учитывать тот факт, что ОСАГО рассчитывается отдельно для юридических и физических лиц, большое значение имеет вид транспорта, место его регистрации и стаж вождения страхователя.

Общая формула расчет полиса ОСАГО

Формула расчета ОСАГО заключает в себе наличие базового тарифа, умноженного на разные коэффициенты, предусмотренные законодательством, и выглядит следующим образом: Полис ОСАГО = КБ x КТ x КБМ x КО x КВС x КС x КМ x КН x КП, где аббревиатуры имеют следующие определения: 

  • КБ –коэффициент базовый
  • КТ – коэффициент территориальный
  • КБМ — коэффициент бонус-малус
  • КО – коэффициент ограничивающий
  • КВС – коэффициент возраст-стаж
  • КС – коэффициент сезонности
  • КМ – коэффициент мощности двигателя транспортного средства
  • КН – коэффициент нарушений
  • КП – коэффициент срока страхования

Рассмотрим каждый показатель формулы более подробно.

Базовый коэффициент ОСАГО

Начальную сумму страховки для каждого вида транспортного средства устанавливает государство. Размер коэффициента напрямую зависит от статуса собственника автомобиля и непосредственно от типа транспортного средства. Например, базовый тариф страховки для организации, оказывающей услуги перевозки, будет существенно выше, чем основной тариф для физического лица с личным автомобилем. 

Важно! Ранее базовый тариф представлял собой только фиксированную сумму, однако с вступлением в силу нового законодательства, тариф за последние несколько лет повысился для легковых автомобилей на 40%, для других транспортных средств он, напротив, стал ниже. Кроме того, страховые компании вправе устанавливать свой базовый тариф в рамках +/-20%, узаконив, так называемый, тарифный коридор.

Скачать таблицу значений базовых ставок страховых тарифов ОСАГО

Территориальный понижающий коэффициент ОСАГО

Значение данного коэффициента имеет прямое влияние на стоимость полиса ОСАГО. Основа территориального коэффициента заключается в том, что в разных регионах и населенных пунктах существуют собственные скидки и надбавки на коэффициент. Связано это с тем, что чем больше численность населения, и, соответственно, больше машин, тем больше риска попасть в ДТП, следовательно, территориальный коэффициент, например в Москве, будет гораздо выше, чем в небольшом населенном пункте, скажем Якутской области. 

Важно! Территориальный коэффициент ОСАГО зависит от того, где собственник транспортного средства имеет регистрацию, а не от места фактического проживания.

Коэффициент бонус-малус (КБМ) или безаварийности

КМБ напрямую зависит от того, насколько редко/часто водитель является виновником аварии. Ассоциация автостраховщиков собирает сведения об аварийности и страховых случаях ОСАГО, которые хранятся в единой базе данных. Получить необходимые сведения совершенно бесплатно может каждый автомобилист, обратившись дистанционно к базе на сайте РСА, нужно лишь знать данные о предыдущем страховании. Также коэффициент безаварийности можно рассчитать самостоятельно, зная необходимые значения – минимальный коэффициент может составлять 0,5, максимальный – 2,45. 

Важно! КМБ присваивается непосредственно каждому водителю, а не автомобилю. Если договор автострахования заключается впервые, коэффициент будет всегда равняться единице.

Скачать таблицу значений коэффициента бонус-малус (КБМ)

Коэффициент ограничивающий ОСАГО

Данный коэффициент рассчитывается на основании того, сколько водителей будет вписано в страховой полис. Ограничивающий коэффициент включает в себя две категории: 

  • Ограниченная страховка, куда может быть вписано до пяти водителей с указанием ФИО, дата рождения, номера водительского удостоверения и других данных. Коэффициент будет рассчитываться исходя из коэффициента возраст-стаж.
  • Неограниченная страховка – в данном случае управлять транспортным средством может неограниченное число водителей. Коэффициент имеет фиксированное значение и равен показателю 1,8.

Коэффициент ОСАГО возраст-стаж

Значения этого коэффициента также имеет большое значение для определения итоговой стоимости полиса ОСАГО. Коэффициент возраст-стаж определяется по следующему критерию: чем больше возраст и стаж водителя, тем меньше значение коэффициента. На сегодняшний день существуют цифры, устанавливающие барьер при расчете коэффициента: 

  • если возраст водителя менее 22-х лет и стаж вождения не достиг 3-х лет, коэффициент присваивается самый высокий -1,8;
  • если возраст водителя более 22-х лет и стаж вождения не достиг 3-х лет, коэффициент присваивается с показателем — 1,7;
  • если возраст водителя менее 22-х лет, но стаж вождения достиг 3-х лет, коэффициент присваивается самый высокий — 1,6;
  • если возраст водителя более 22-х лет и стаж вождения более 3-х лет, коэффициент присваивается с показателем – 1.

Коэффициент сезонности ОСАГО

Законодатель предусмотрел тот факт, что определенное число автомобилистов водят транспортное средства сезонно, например, только в теплое время года. К таким категориям граждан можно отнести дачников или тех, чья профессия неразрывно связанна с длительными командировками. Если нет желания переплачивать за автострахование, ОСАГО можно оформить по сезонному полису. Оформить полис с сезонным коэффициентом можно на срок от 3-х до 10 месяцев. Коэффициент рассчитывается на основе срока, на который приобретается полис: 

  • 3 месяца – показатель коэффициента 0.5;
  • 4 месяца – 0.6;
  • 5 месяца – 0.65;
  • 6 месяца – 0.7;
  • 7 месяца – 0.8;
  • 8 месяца – 0.9;
  • 9 месяца – 0.95;
  • 10 и более месяцев –1.

Коэффициент мощности двигателя

Также, как и указанные выше факторы, на конечную стоимость полиса ОСАГО влияет мощность двигателя транспортного средства. Суть расчета данного коэффициента проста – чем больше лошадиных сил в автомобиле, тем выше будет коэффициент: 

  • до 50 лошадиных сил – 0,6
  • 50 — 70 лошадиных сил – 1
  • 70 — 100 лошадиных сил – 1,1
  • 100 — 120 лошадиных сил – 1,2
  • 120 — 150 лошадиных сил – 1,4
  • более 150 лошадиных сил – 1,6

Коэффициент нарушений ОСАГО

Данный коэффициент с показателем 1,5 применяется не ко всем страхователям, а только в тех случаях, когда были обнаружены нарушения страхования, такие как: 

  1. вождения автомобиля в состоянии алкогольного или наркотического опьянения;
  2. сообщение заведомо ложных сведений;
  3. оставления места ДТП;
  4. умышленное содействие наступлению дорожно-транспортного происшествия;
  5. нахождение за рулем автомобиля лица, не вписанного в полис ОСАГО;
  6. другие нарушение, предусмотренные Федеральным законом об обязательном страховании.

Важно! Данный коэффициент имеет небольшую хитрость – его историю можно обнулить. Коэффициент нарушений будет равен 0 через год, если виновный водитель в течении этого года не будет заключать новый договор ОСАГО.

Коэффициент срока страхования ОСАГО

Срок страхования при осуществлении обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств, следующих к месту регистрации транспортного средства, а также к месту проведения технического осмотра транспортного средства и повторного технического осмотра транспортного средства, составляет до 20 дней включительно, и в этом случае применяется коэффициент КП — 0,2.

Скачать таблицу значений коэффициента срока страхования ОСАГО

Понижающий коэффициент ОСАГО – конечная стоимость

Таким образом, можно определить, что рассчитать конечную стоимость страхового полиса ОСАГО не так уж и сложно. В общем понятии: 

  1. самая высокая стоимость страхования будет для молодых водителей, имеющих небольшой стаж вождения, живущих в больших городах и управляющих автомобилями с наиболее мощным двигателем;
  2. самая низкая стоимость страхования будет предложена водителям с большим опытом вождения и 10-ти летним стажем безаварийной езды, которые проживают в небольших населенных пунктах и управляют автомобилями с небольшой мощностью двигателя.

Стоит отметить, что стоимость полиса ОСАГО совершенно не обязательно рассчитывать самостоятельно, это можно сделать в любой страховой компании совершенно бесплатно, как посредством личного обращения, так и через онлайн-калькулятор.

Коэффициенты ОСАГО — Как рассчитывается стоимость полиса

Каждый водитель обязан оформить полис ОСАГО, поскольку наличие данного документа гарантирует выдачу финансовой помощи в случае ДТП. В последнее время ситуация на дорогах нашей страны значительно ухудшилась, увеличилось количество аварий, поэтому наличие полиса является необходимостью и тем документом, который должен иметь каждый владелец автомобиля. Отсутствие полиса влечет за собой наложение штрафа, размер которого колеблется в пределах от 425 до 850 гривен.

В сегодняшней статье мы подробно разберем, как осуществить расчет ОСАГО и узнать размер страховых выплат по страховке. Для осуществления подобной процедуры необходимо умножить определенные коэффициенты на базовый тариф. Итоговая стоимость ОСАГО целиком зависит от размера базового тарифа, который устанавливается государством и коэффициентами. Коэффициенты представляют собой некие дополнения, размер которых существенно отражается на итоговой стоимости ОСАГО.

Как рассчитать стоимость ОСАГО по формуле?

Все страховые агентства для расчета стоимости полиса ОСАГО применяют специальную формулу. Для расчета необходимо знать размер базового тарифа, который затем умножают на разные коэффициенты. Существующие коэффициенты бывают двух видов: постоянные и изменяющиеся. Итак, самостоятельно рассчитать итоговую стоимость полиса можно по формуле:

Стоимость(ОСАГО) = БТ ∙ К1 ∙ К2 ∙ К3 ∙ К4 ∙ К5 ∙ К6 ∙ БМ ∙ СЛ,

где БТ – базовый тариф, К1 – тип транспортного средства, К2 – место регистрации авто, К3 – где эксплуатируется транспортное средства, К4 – стаж, К5 – эксплуатационный период, К6 – случаи мошенничества, БМ – бонус-малус, СЛ – скидки для льготного контингента.

Учтите, что на окончательную стоимость страховки влияют разные факторы и их необходимо обязательно учитывать при расчете. Совершить расчет стоимости ОСАГО можно самостоятельно либо воспользовавшись бесплатным онлайн калькулятором, который присутствует практически на каждом официальном сайте страховой компании.

Коэффициент водительского стажа ОСАГО (КВС)

Что такое КВС в страховом полисе ОСАГО? Как рассчитать и проверить коэффициент КВС по таблице в страховом полисе ОСАГО в 2020 году?

Более десяти лет оформление полиса гражданской ответственности ОСАГО является обязательным для российских автомобилистов. Если раньше для заключения договора нужно было являться в офис страховой компании, то с июля 2015 года у водителей появилась возможность оформлять электронные полисы е-ОСАГО в режиме онлайн. При этом автовладельцу нужно знать принцип расчета стоимости автостраховки и корректирующие коэффициенты, в том числе КВС, который зависит от возраста и стажа вождения конкретного человека. Найти необходимые значения и выполнить расчет ОСАГО самостоятельно можно на портале inguru.ru/kalkulyator_osago/reg_irkutskaja_oblast.

Физическим лицам, которые заинтересованы в оформлении полиса ОСАГО, следует знать, что означает коэффициент КВС для правильного использования стандартной формулы расчета. Значения данного показателя представлены в таблице КВС, которая ежегодно обновляется и публикуется на сайте ОСАГО. Существующие коэффициенты определяются правительством и относятся к повышающим. Для оптимизации страховых взносов таблица претерпела существенные изменения в январе 2019 года. В ней появились: восемь новых градаций, позволяющих выполнить классификацию по стажу вождения; семь градаций, устанавливающих разделение водителей по возрасту.

Такой же принцип формирования таблицы был использован в 2020 году. Благодаря нововведениям у части опытных водителей с большим стажем появилась возможность получить дополнительную скидку в размере до 7 % при оформлении ОСАГО (при КВС, равном 0,93), в то время, как для молодых неопытных водителей стоимость полиса возросла почти вдвое. Для них КВС вырос до значения 1,87. Такая позиция регулятора объясняется тем, что молодежь часто не чувствует социальной ответственности и нарушает правила ПДД.

Как рассчитать коэффициент стажа?

При оформлении договора страхования ОСАГО в режиме онлайн автовладельцу необходимо, помимо базовой стоимости полиса, знать ряд коэффициентов, в том числе персональный КВС, зависящий от возраста водителя и стажа вождения. Для этого в столбце с градацией по возрасту следует выбрать нужную строку, после чего в верхней строке найти столбец со своим стажем вождения. Искомый коэффициент находится на пересечении выбранной строки и столбца.

При определении КВС следует учитывать, что показатель не принимается в расчет при оформлении ОСАГО на прицеп, а также на транспортные средства, оформленные на юридических лиц. Кроме того, для транспортных средств с иностранной регистрацией применяются КВС:

1,7 — для транспорта, находящегося в собственности физических лиц или индивидуальных предпринимателей;

1 — для автомобилей, принадлежащих предприятиям и компаниям, которые являются юридическими лицами.

При расшифровке КВС в ОСАГО принимается во внимание возраст и стаж вождения. Если в автогражданке страховую ответственность разделяют несколько физических лиц, то КВС определяется по каждому водителю отдельно. При этом страхователи принимают для расчета ОСАГО максимальный коэффициент, акцентируя внимание на самом молодом и неопытном водителе.

Как проверить КВС?

Очень часто страховые компании при определении цены ОСАГО используют базовую стоимость страховки и коэффициенты по своему усмотрению. Чтобы не переплачивать за страховой полис ОСАГО в 2020 году, можно выполнить расчет самостоятельно: для этого следует уточнить значение повышающего коэффициента КВС, зависящее от возраста и водительского стажа автовладельца. Таблицу КВС и другие показатели для определения стоимости автостраховки можно найти на портале страховых услуг inguru.ru/kalkulyator_osago. На сайте также представлен полный список страховых компаний, оформляющих ОСАГО в режиме онлайн. Для расчета стоимости страховки с помощью онлайн-калькулятора нужно правильно ввести свои данные в электронную форму и нажать на клавишу «Рассчитать».

как применяется и какие тарифы

Использующийся в ОСАГО территориальный коэффициент – это один из факторов, от которого зависит, сколько денег придется выложить за полис. Хотите платить за страховку в три раза меньше? Тогда читайте эту статью, и вы узнаете, как это возможно.

Я серьезно. Это Кулик Илья, и сегодня расскажу все о коэффициенте территории, чему он равен, как применяется и когда с его помощью можно сэкономить.

Что такое коэффициент в ОСАГО

Как вам наверняка известно, стоимость страховки ОСАГО рассчитывается всеми компаниями одинаково строго по установленной государством схеме. Ее суть такова: базовая ставка, то есть определенная сумма, которую в небольших пределах страховая может выбрать самостоятельно, умножается на несколько коэффициентов, которые зависят от данных того, кто и что страхует.

Размер как базовой ставки, так и каждого из коэффициентов определяются Банком России. Эти коэффициенты могут быть как понижающими, так и увеличивающими цену полиса, а также не влияющими на нее. Коэффициент меньше единицы – стоимость понижается, больше единицы – наоборот, равен одному – размер стоимости не меняется.

Применение установленных государственным органом коэффициентов позволяет точно рассчитывать стоимость страховки самостоятельно, в том числе с применением соответствующих интернет-сервисов, например, на сайте РСА.

Для чего применяются коэффициенты

Зачем вообще нужны эти коэффициенты? Дело в том, что в зависимости от различных факторов меняется вероятность риска попадания в аварию, а, следовательно, и необходимости выплат по страховке. Согласитесь, что вероятность столкнуться с другим авто в Москве и в отдаленной сибирской деревеньке совсем неодинакова. То же самое можно сказать и про стаж водителя.

То есть считается, что водителю А выплата может потребоваться чаще, чем водителю В, поэтому и цена «автогражданки» для первого из них будет больше.

Поэтому, чтобы те, кто не попадает в аварии не платили за тех, для кого ДТП не редкость и введены эти коэффициенты. Конечно, они далеко не всегда обеспечивает полную справедливость, но в некоторых случаях помогут существенно снизить цену страховки.

Как влияет на стоимость ОСАГО коэффициент территории

Как следует из названия из-за коэффициента территории (КТ) цена полиса будет меняться в зависимости от места, где в основном используется автомобиль. Дело в том, что чем больше машин на дорогах, тем более вероятно, что нескольким из них «не хватит места», и произойдет ДТП. Поэтому КТ будет наиболее большим в мегаполисах, поменьше в некрупных городах, и наиболее низким – в мелких населенных пунктах.

А также при установке тарифов на территориальный коэффициент используется статистика по авариям в рассматриваемом регионе. Чем их больше произошло за определенный период – тем выше будет значение КТ.

Наибольший из установленных значений – 2,1 применяется для Мурманска и Челябинска, наименьший – 0,6 для небольших городов и поселений, как правило, периферийных областей. То есть разница в страховке при прочих равных условиях может отличаться для разных мест в три с половиной раза!

Примечание. Для тракторов и прочей подобной техники используются свои КТ.

Примеры применения

Коэффициент территории различается не только по областям и регионам, но и по отдельным населенным пунктам. Так, в Краснодарском крае действуют 5 различных коэффициентов. Наибольший из них используется для городов Краснодар и Новороссийск – 1,8. Для расположенных рядом Анапы, Славянска-на-Кубани и Темрюка он составит соответственно 1,3 1,1 и 1. А, например, в Туапсе – 1,2.

Хочу обратить внимание, что площадь и население не напрямую влияют на КТ. Так коэффициент Краснодара высокий, такой же, как и в Нижнем Новгороде, Ростове-на-Дону, Уфе. При этом в Волгограде тоже большом городе, превышающем Краснодар по площади и населению, этот показатель равняется 1,3. Для сравнения, КТ небольшого города Бийск в Алтайском крае – 1,2.

Какой адрес используют для расчета КТ

Для расчета территориального коэффициента используется место жительства собственника транспортного средства. Причем эту информацию можно брать как из гражданского паспорта, так и из ПТС или свидетельства о регистрации ТС. Страхователь не всегда является собственником автотранспортного средства, учитывайте это.

Для юридических лиц и их филиалов определяющим будет его местонахождение, указанное в учредительном документе.

Также очевидно, что цена страховки не будет зависеть от места ее покупки. То есть если вы зарегистрированы, например, в Вологде, а купили машину, поставили ее на учет и хотите оформить страховку в Екатеринбурге, то будет применяться КТ для Вологды.

Можно ли сэкономить при проживании по временной регистрации

В ст. 9 Закона «Об ОСАГО» прописано, что КТ определяется по месту жительства собственника, которое указано в:

  • паспорте РФ;
  • ПТС;
  • свидетельстве о регистрации ТС.

Временная прописка в паспорте не указывается, так что первый вариант сразу отпадает. А в документах на машину, выдающихся ГАИ, с 2013 года указываются сведения только о постоянной регистрации, если она есть. Временной регистрации ТС сейчас не существует.

Таким образом, применяться КТ по временной регистрации может, только если постоянной регистрации нет, а в документах на авто указан адрес временной. А также если у вас еще действуют документы на авто, полученные по временной прописке.

Страхование по временной регистрации – опасно

Если поискать по форумам в интернете, можно найти немало случаев, когда страховщики используют при расчете коэффициента территории адрес временного пребывания, хотя далеко не все страховые это практикуют.

При этом существует риск, что возникнут проблемы, особенно, при обращении в другое отделение страховой компании. За указание ложных сведений при заключении договора ОСАГО могут применяться увеличивающие коэффициенты, а также сама страховка может быть признана недействительной.

Наличие страховки у потерпевшего не влияет на получение выплаты. Значение имеет только полис виновника. А если его полис признают недействительным из-за ложных сведений к СК потерпевший не может предъявить никаких требований, возмещение возможно только с виновника.

В общем, несовпадение данных о прописке в полисе и паспорте виновника ДТП может привести к судебным разбирательствам ненужным ни потерпевшему, ни виновнику, ни страховой. Поэтому я советую не пытаться сэкономить на страховке таким полузаконным способом.

Как сэкономить при страховании

Единственный действительно законный способ снизить цену на полис ОСАГО – если его собственник будет иметь постоянную регистрацию в населенном пункте с низким КТ. Понятно, что покупать дом в районе и прописываться там ради нескольких (пусть даже 10-15) тысяч не стоит.

Так что выход один – «продать» авто родственнику/другу, прописанному в «дешевом» месте проживания. То есть заключить с ним договор купли-продажи, и договориться с ним, чтобы он оформил машину на себя, но ездить будете вы. Но и у этого способа есть свои недостатки.

Какие проблемы могут возникнуть

Во-первых, к сожалению, бывает так, что даже между самыми близкими людьми и лучшими друзьями портятся отношения. То есть существует вероятность того, что в один «прекрасный» день реальный собственник потребует авто себе, и сделать с этим вы ничего не сможете. Так как по всем документам это его имущество, что он с легкостью докажет и в суде, если потребуется.

Во-вторых, никто из нас не вечен. И если тот, с кем вы договорились о таком пользовании автомашиной, умрет, право на это авто получат наследники. Вступление в наследство может затягиваться до полугода, то есть в течение этого времени ездить будет нельзя.

И, опять же, есть риск того, что наследник захочет сам пользоваться автомобилем, законным собственником которого он стал. Конечно, если вы сами имеете право на наследство этого автомобиля (являетесь прямым родственником умершего, или указаны в завещании), то все несколько проще.

Таблица значений

Значения коэффициента установлены Центральным Банком в Указании №3384-У от 19.09.14. В 2015 году в него внесли изменения. Также в отдельном письме ЦБ РФ говорится, что для Крыма применяется упомянутое Указание.

Территория преимущественного использования транспортного средства (место регистрации собственника транспортного средства, указанное в гражданском паспорте, ПТС или свидетельстве о регистрации ТС)Коэффициент для транспортных средств, за исключением тракторов, самоходных дорожно-строительных и иных машинКоэффициент для тракторов, самоходных дорожно-строительных и иных машин, за исключением транспортных средств, не имеющих колесных движителей
Республика Адыгея
Все города и населенные пункты1,31
Республика Алтай
Горно-Алтайск1,30,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Республика Башкортостан
Благовещенск, Октябрьский1,20,8
Ишимбай, Кумертау, Салават1,10,8
Стерлитамак, Туймазы1,30,8
Уфа1,81
Прочие города и населенные пункты10,8
Республика Бурятия
Улан-Удэ1,30,8
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Республика Дагестан
Буйнакск, Дербент, Каспийск, Махачкала, Хасавюрт0,70,5
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Республика Ингушетия
Малгобек0,80,5
Назрань0,60,5
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Кабардино-Балкарская Республика
Нальчик, Прохладный10,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Республика Калмыкия
Элиста1,30,8
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Карачаево-Черкесская Республика10,8
Республика Карелия
Петрозаводск1,30,8
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Республика Коми
Сыктывкар1,61
Ухта1,30,8
Прочие города и населенные пункты10,8
Республика Крым
Севастополь0,60,6
Симферополь0,60,6
Прочие города и населенные пункты0,60,6
Республика Марий Эл
Волжск10,8
Йошкар-Ола1,40,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Республика Мордовия
Рузаевка1,21
Саранск1,51
Прочие города и населенные пункты0,80,6
Республика Саха (Якутия)
Нерюнгри0,80,5
Якутск1,20,7
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Республика Северная Осетия — Алания
Владикавказ10,8
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Республика Татарстан
Альметьевск, Зеленодольск, Нижнекамск1,30,8
Бугульма, Лениногорск, Чистополь10,8
Елабуга1,20,8
Казань21,2
Набережные Челны1,71
Прочие города и населенные пункты1,10,8
Республика Тыва
Кызыл0,60,5
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Удмуртская Республика
Воткинск1,10,8
Глазов, Сарапул10,8
Ижевск1,61
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Республика Хакасия
Абакан, Саяногорск, Черногорск10,8
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Чеченская Республика
Все города и населенный пункты0,60,5
Чувашская Республика
Канаш1,10,8
Новочебоксарск1,20,8
Чебоксары1,71
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Алтайский край
Барнаул1,71
Бийск1,20,8
Заринск, Новоалтайск, Рубцовск1,10,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Забайкальский край
Краснокаменск0,60,5
Чита0,70,5
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Камчатский край
Петропавловск-Камчатский1,31
Прочие города и населенные пункты10,6
Краснодарский край
Анапа, Геленджик1,30,8
Армавир, Сочи, Туапсе1,20,8
Белореченск, Ейск, Кропоткин, Крымск, Курганинск, Лабинск, Славянск-на-Кубани, Тимашевск, Тихорецк1,10,8
Краснодар, Новороссийск1,81
Прочие города и населенные пункты10,8
Красноярский край
Ачинск, Зеленогорск1,10,8
Железногорск, Норильск1,30,8
Канск, Лесосибирск, Минусинск, Назарово10,8
Красноярск1,81
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Пермский край
Березники, Краснокамск1,30,8
Лысьва, Чайковский10,8
Пермь21,2
Соликамск1,20,8
Прочие города и населенные пункты1,10,8
Приморский край
Арсеньев, Артем, Находка, Спасск-Дальний, Уссурийск10,8
Владивосток1,41
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Ставропольский край
Буденновск, Георгиевск, Ессентуки, Минеральные Воды, Невинномысск, Пятигорск10,8
Кисловодск, Михайловск, Ставрополь1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Хабаровский край
Амурск10,8
Комсомольск-на-Амуре1,30,8
Хабаровск1,71
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Амурская область
Белогорск, Свободный1,10,9
Благовещенск1,60,9
Прочие города и населенные пункты10,6
Архангельская область
Архангельск1,81
Котлас1,61
Северодвинск1,71
Прочие города и населенные пункты0,850,5
Астраханская область
Астрахань1,41
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Белгородская область
Белгород1,30,8
Губкин, Старый Оскол10,8
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Брянская область
Брянск1,51
Клинцы10,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Владимирская область
Владимир1,61
Гусь-Хрустальный1,10,8
Муром1,20,8
Прочие города и населенные пункты10,8
Волгоградская область
Волгоград1,30,8
Волжский1,10,8
Камышин, Михайловка10,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Вологодская область
Вологда1,71
Череповец1,81
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Воронежская область
Борисоглебск, Лиски, Россошь1,10,9
Воронеж1,51,1
Прочие города и населенные пункты0,80,6
Ивановская область
Иваново1,81
Кинешма1,10,8
Шуя10,8
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Иркутская область
Ангарск1,20,8
Братск, Тулун, Усть-Илимск, Усть-Кут, Черемхово10,8
Иркутск1,71
Усолье-Сибирское1,10,8
Шелехов1,30,8
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Калининградская область
Калининград1,10,8
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Калужская область
Калуга1,20,8
Обнинск1,30,8
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Кемеровская область
Анжеро-Судженск, Киселевск, Юрга1,20,8
Белово, Березовский, Междуреченск, Осинники, Прокопьевск1,30,8
Кемерово1,91
Новокузнецк1,81
Прочие города и населенные пункты1,10,8
Кировская область
Киров1,41
Кирово-Чепецк1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Костромская область
Кострома1,30,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Курганская область
Курган1,40,8
Шадринск1,10,8
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Курская область
Железногорск10,8
Курск1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Ленинградская область
Санкт-Петербург1,81
Прочие города и населенные пункты1,30,8
Липецкая область
Елец10,8
Липецк1,51
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Магаданская область
Магадан0,70,5
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Московская область
Москва21,2
Прочие города и населенные пункты1,71
Мурманская область
Апатиты, Мончегорск1,31
Мурманск2,11,2
Североморск1,61
Прочие города и населенные пункты1,21
Нижегородская область
Арзамас, Выкса, Саров1,10,8
Балахна, Бор, Дзержинск1,30,8
Кстово1,20,8
Нижний Новгород1,81
Прочие города и населенные пункты10,8
Новгородская область
Боровичи10,8
Великий Новгород1,30,8
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Новосибирская область
Бердск1,30,8
Искитим1,20,8
Куйбышев10,8
Новосибирск1,71
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Омская область
Омск1,61
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Оренбургская область
Бугуруслан, Бузулук, Новотроицк10,8
Оренбург1,71
Орск1,10,8
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Орловская область
Ливны, Мценск10,8
Орел1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Пензенская область
Заречный1,20,8
Кузнецк10,8
Пенза1,41
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Псковская область
Великие Луки10,8
Псков1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Ростовская область
Азов1,20,8
Батайск1,30,8
Волгодонск, Гуково, Каменск-Шахтинский, Новочеркасск, Новошахтинск, Сальск, Таганрог10,8
Ростов-на-Дону1,81
Шахты1,10,8
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Рязанская область
Рязань1,41
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Самарская область
Новокуйбышевск, Сызрань1,10,8
Самара1,61
Тольятти1,51
Чапаевск1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Саратовская область
Балаково, Балашов, Вольск10,8
Саратов1,61
Энгельс1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Сахалинская область
Южно-Сахалинск1,51
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Свердловская область
Асбест, Ревда1,10,8
Березовский, Верхняя Пышма, Новоуральск, Первоуральск1,30,8
Верхняя Салда, Полевской1,20,8
Екатеринбург1,81
Прочие города и населенные пункты10,8
Смоленская область
Вязьма, Рославль, Сафоново, Ярцево10,8
Смоленск1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,70,5
Тамбовская область
Мичуринск10,8
Тамбов1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Тверская область
Вышний Волочек, Кимры, Ржев10,8
Тверь1,51
Прочие города и населенные пункты0,80,5
Томская область
Северск1,20,8
Томск1,61
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Тульская область
Алексин, Ефремов, Новомосковск10,8
Тула1,51
Узловая, Щекино1,20,8
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Тюменская область
Тобольск1,30,8
Тюмень21,2
Прочие города и населенные пункты1,10,8
Ульяновская область
Димитровград1,20,9
Ульяновск1,51,1
Прочие города и населенные пункты0,90,6
Челябинская область
Златоуст, Миасс1,40,8
Копейск1,61
Магнитогорск1,81
Сатка, Чебаркуль1,20,8
Челябинск2,11,3
Прочие города и населенные пункты10,8
Ярославская область
Ярославль1,51
Прочие города и населенные пункты0,90,5
Еврейская автономная область
Биробиджан0,60,5
Прочие города и населенные пункты0,60,5
Ненецкий автономный округ
Все города и населенный пункты0,80,5
Ханты-Мансийский автономный округ — Югра
Когалым10,8
Нефтеюганск, Нягань1,30,8
Сургут21,2
Нижневартовск1,81
Ханты-Мансийск1,51
Прочие города и населенные пункты1,10,8
Чукотский автономный округ
Все города и населенный пункты0,60,5
Ямало-Ненецкий автономный округ
Новый Уренгой10,8
Ноябрьск1,71
Прочие города и населенные пункты1,10,8
Байконур0,60,5

Для удобства сделал таблицу отдельным файлом:

Скачать таблицу актуальных значений территориального коэффициента в ОСАГО.

Так что скачивайте, изучайте, решайте где на Руси жить хорошо :cool:.

Подведем итоги

  • стоимость полиса ОСАГО изменяется от территории;
  • место постоянной регистрации собственника ТС – определяющие для КТ;
  • значения территориального коэффициента устанавливаются ЦБ РФ;
  • попытки сэкономить на КТ в большинстве случаев рискованны.

Заключение

Ну вот и разобрались с коэффициентом территории, применяющимся в ОСАГО. Как видите, даже для жителей двух соседних городов, стоимость «автогражданки» может значительно различаться.

Если есть вопросы по теме, спрашивайте в комментариях. А если есть интересный опыт в применении КТ, обязательно расскажите о нем там же.

Видео-бонус: 5 найденных видеопленок, которые ужаснули всех.

Подписывайтесь на блог, читайте новые статьи, делитесь ссылками на эту и другие записи блога в социальных сетях. Всем пока.

Ингибирование ДНК-примазы нуклеозидтрифосфатами и их арабинофуранозиловыми аналогами

ДНК-примаза (EC 2.7.7.6) продуцирует олигомер РНК из примерно 10 оснований, который требуется ДНК-полимеразе альфа (EC 2.7.7.7) для инициации синтеза ДНК. Мы частично очистили ДНК-примазу из клеток острого лимфолейкоза пациентов с использованием нескольких хроматографических колонок. Поли (dT) и поли (dC), но не поли (dA) или поли (dG), были хорошими матрицами для рибонуклеозидтрифосфатного (rNTP) -зависимого синтеза ДНК (т.е.например, активность ДНК-примазы), и они были использованы при изучении влияния природных и арабинофуранозилнуклеозидтрифосфатов на активность ДНК-примазы. Km для GTP в анализе поли (dC) примазы составляла приблизительно 175 мкМ. Все некомплементарные природные rNTP и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) в одинаковой степени ингибировали активность поли (dC) примазы (значения Ki АТФ и CTP составляли 610 и 517 мкМ соответственно). 1-бета-D-арабинофуранозилцитозин 5′-трифосфат (araCTP) и 9-бета-D-арабинофуранозиладенин 5′-трифосфат (araATP) были более мощными ингибиторами активности поли (dC) примазы, чем CTP и ATP (значения Ki были приблизительно равны 125 мкМ).araCTP, araATP, CTP и ATP ингибировали активность ДНК-примазы способом, конкурирующим с GTP. Концентрация, необходимая для подавления активности поли (dC) ДНК-примазы на 50%, была определена для ряда аналогов арабинофуранозилнуклеозидтрифосфата, и относительная сила ингибирования активности ДНК-примазы была следующей: rNTP = dNTP = 5-аза-dCTP меньше чем ара-5-азаЦТФ = араТТФ = араАТФ = араЦТФ менее 2-фтора-араАТФ = 2′-азидо-2′-дезокси араЦТФ менее 2′-фторатараТТФ = 2′-фтор-5-йодо-араЦТФ = 2′-фтор-5-метил-араСТФ.В анализе поли (dT) примазы АТФ не следует классической кинетике Михаэлиса-Ментен (АТФ проявляет положительную кооперативность с коэффициентом Хилла 2,0). Однако этот анализ был очень чувствителен к araCTP (кажущаяся Ki 25 мкМ). Таким образом, эти эксперименты показали, что ДНК-примаза контролируется уровнями рибонуклеозидтрифосфатов, и что нарушение этих пулов любым агентом может привести к ингибированию ДНК-примазы и тем самым ингибировать синтез ДНК. Кроме того, аналоги арануклеозидтрифосфата напрямую ингибируют ДНК-примазу, и возможно, что этот эффект может способствовать цитотоксичности этих соединений.

Новые тарифы на страхование: как изменить стоимость полиса

18 июня. Банк России на своем официальном сайте опубликовал проект инструкции о пределах базовых ставок и тарифных коэффициентов ОСАГО, а также о порядке их использования страховщиками при расчете стоимости полиса ОСАГО.

Это первый шаг в реформировании ОСАГО. Предполагается, что в результате этой реформы страховые компании смогут назначать более разумные цены на полисы в зависимости от ситуации с убытками.А также смогут более индивидуально подойти к каждому клиенту. Планируется, что такой подход снизит стоимость полиса для опытных и возрастных водителей в неприбыльных регионах. Для водителей, попавших в аварию, стоимость полиса увеличится. Однако пока рано говорить, к чему приведут такие изменения.

Тарифный коридор

Изменения предполагают расширение тарифного коридора:

  • нижний предел для всех видов транспорта будет снижен на 20%,
  • верхний предел будет уменьшен на 10.9% на мотоциклы и скутеры%,
  • верхний предел будет снижен для автомобилей в собственности юридических лиц на 5,7%.
  • верхний предел для остального транспорта увеличится на 20%.

В конечном итоге для физических лиц, владеющих автомобилями, тарифный коридор составит от 2 до 4 746 942 руб. Именно в этих пределах страховщики установят базовую ставку, из которой будет вычитаться стоимость страхового полиса.

Эксперты считают, что конкуренция не позволит страховым компаниям устанавливать максимальные тарифы.Но автовладельцы обоснованно опасаются, что страховщики не упустят возможность поднять цены. 20 процентов сверху — это хорошая прибавка.

Страховые компании обязаны разработать тариф, опубликовать его на официальном сайте компании и уведомить об этом ЦБ.

История водителя и бонус-Malus

Важно ! История водителя не сбрасывается, даже если он не покупал полис в течение года.

Коэффициент «бонус-малус», значение которого зависит от аварийности водителя, будет устанавливаться один раз в год.Однако он будет только один. В настоящее время у драйвера может быть несколько таких коэффициентов. Такая ситуация может возникнуть, если у гражданина есть собственная машина, застрахованная ОСАГО, и он включен в другие полисы ОСАГО. Сколько полисов, столько разногласий. Такая ситуация приводит к спорам со страховщиками, а иногда и к необоснованному завышению стоимости полиса. Когда соотношение бонус-малус равно единице, таких проблем не будет.

При переходе на новую систему драйверу будет присвоен минимум из доступных коэффициентов.

Юридическим лицам будет присвоен один бонус-малус коэффициент на весь автопарк. Теперь он разный для каждой машины в автопарке. Эта ситуация также приводит к путанице и мошенничеству со стороны владельца автопарка.

Не сбрасывают историю драйвера . Присвоенный коэффициент останется у водителя, даже если он не застрахует автомобиль в течение года. Теперь, если драйвер, например, не приобрел годовой полис ОСАГО, его история сжигается.А при покупке нового полиса бонус-малус снова будет равен единице.

Коэффициенты стажа и возраста

Вместо четырех коэффициентов, действовавших ранее, они будут равны 50. Самый низкий коэффициент будет присвоен водителям старше 35 лет и стажем вождения более 3 лет. Будет 0,96 вместо текущей единицы. Для молодых и неопытных водителей коэффициент будет увеличиваться.

Таким образом, для водителей младше 21 года и стажа вождения менее 2 лет коэффициент будет равен 1.87 (вместо 1,8).

Хуже всего придется водителям среднего возраста (22 — 34 года) со стажем вождения более 3 лет, для них коэффициент будет увеличиваться. Значит, подорожает страховой полис.

Коэффициент страхового тарифа в зависимости от возраста и стажа водителя, допущенного к управлению автомобилем

Возраст, лет

Стаж, лет

0 1 2 3–4 5–6 7–9 10–14 более 14
16-21 1.87 1,87 1,87 1,66 1,66
22-24 1,77 1,77 1,77 1.04 1.04 1.04
25 — 29 1,77 1,69 1,63 1. 04 1.04 1.04 1.01
30-34 1,63 1,63 1,63 1.04 1.04 1.01 0,96 0,96
35 — 39 1,63 1,63 1,63 0,99 0,96 0,96 0,96 0,96
40-49 1,63 1.63 1,63 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96
более 49 1,63 1,63 1,63 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96

Когда документ будет принят и вступит в силу, неизвестно. Публичное обсуждение документа продлится до 20 июня. Заместитель председателя Банка России Владимир Чистюхин ранее заявлял, что документ планируется принять в августе.

Текст документа можно найти по ссылке «Указание Банка России» о пределах основных ставок страховых тарифов, страховых тарифных коэффициентах, требованиях к структуре страховых тарифов, а также порядке их внесения. их применение страховщиками при определении страховой премии по договору обязательного страхования гражданской ответственности владельцев транспортных средств ».

#CTP # Тарифы CTP # Новости CTP #CTP 2018 # Bonus-Malus

VK

Facebook

Twitter

Google+

Одноклассники

Почта.ru

Димеризация комплекса PICTS с помощью LC8 / Cut-up запускает котранскрипционное молчание транспозонов у Drosophila

Введение

Большие части эукариотических геномов заняты повторяющимися последовательностями и мобильными генетическими элементами (Cosby, Chang, & Feschotte, 2019 ). Создание de novo гетерохроматина в этих областях предотвращает мобилизацию транспозонов и события аберрантной рекомбинации, а способность малых РНК обеспечивать специфичность последовательности для этого механизма стала фундаментальным элементом систем защиты эукариотического генома (Martienssen & Moazed, 2015). .В частности, ядерные белки Argonaute, связанные с малыми РНК-партнерами, распознают возникающие транскрипты РНК и запускают молекулярный каскад, который приводит к привлечению эпигенетических модификаторов в целевой области (Czech et al., 2018; Martienssen & Moazed, 2015; Ozata, Gainetdinov, Zoch, О’Кэрролл и Замор, 2019). Этот процесс ко-транскрипции в конечном итоге приводит к формированию репрессивной среды хроматина в целевом локусе, причем большая часть нашего понимания происходит из исследований на дрожжах и растениях (Martienssen & Moazed, 2015).

В гонадах животных путь piRNA подавляет активность мобильных элементов, частично за счет котранскрипционного сайленсинга генов (TGS) вставок транспозонов (Czech et al., 2018; Ozata et al., 2019). В Drosophila melanogaster , где этот путь был широко изучен, piRNA-управляемый TGS зависит от PIWI-клады Argonaute белка, Piwi (Klenov et al., 2014; Le Thomas et al., 2013; Rozhkov, Hammell, & Hannon , 2013; Sienski, Donertas, & Brennecke, 2012; Wang & Elgin, 2011). Локусы, на которые нацелена Piwi, связаны с репрессивными состояниями хроматина, отмеченными отсутствием диметилированного h4K4 (h4K4me2) и присутствием ди- и триметилированного h4K9 (h4K9me2 / 3). Эти области также покрыты Heterochromatin Protein 1a (HP1a / Su (var) 205) (Wang & Elgin, 2011). Потеря Piwi приводит к заметной дерепрессии уровней мРНК транспозонов, которая сочетается с потерей репрессивных модификаций гистонов и увеличением занятости РНК-полимеразы II во вставках транспозонов (Klenov et al., 2014; Ле Томас и др., 2013; Рожков и др., 2013; Сиенски и др., 2012; Ван и Элгин, 2011). Контроль транспозонов на уровне транскрипции с помощью ядерных белков PIWI не является уникальным для Drosophila . В эмбриональных семенниках мышей ядерный белок PIWI MIWI2 направляет TGS к эволюционно молодым вставкам транспозонов, которые подавляются в процессе, который изменяет как модификацию гистонов, так и ландшафты метилирования ДНК (Aravin et al., 2008; Carmell et al., 2007; Molaro et al. al., 2014; Pezic, Manakov, Sachidanandam, & Aravin, 2014).Хотя механизм TGS у млекопитающих до конца не изучен, недавняя работа связала двух ядерных партнеров MIWI2, TEX15 и SPOCD1, с этим процессом (Schopp et al., 2020; Zoch et al., 2020).

Молекулярный механизм, связывающий распознавание мишени с помощью Piwi с репрессией транскрипции, еще предстоит полностью решить. Удаление меток метилирования h4K4 зависит от лизиндеметилазы Lsd1 / Su (var) 3-3 при помощи CoRest, в то время как h4K9me3 депонируется гистон-метилтрансферазой dSetDB1 / Eggless (Egg) и ее кофактором Windei (Wde) (Чехия, Preall, McGinn, & Hannon, 2013; Handler et al., 2013; Кох, Хонеманн-Капито, Эггер-Адам и Водарц, 2009; Muerdter et al., 2013; Осуми, Сато, Мурано, Сиоми и Сиоми, 2019 г .; Ранган и др., 2011; Сиенски и др., 2015; Ю. и др., 2015). Связанный с хроматином белок Отсутствие яичников (Ova), который связывает HP1a и Lsd1, лигазу SUMO Su (var) 2-10, ремоделирующий нуклеосомы Mi-2 и гистондеацетилазу Rpd3 дополнительно вносят вклад в процесс образования гетерохроматина (Mugat et al. ., 2020; Ninova et al., 2020; Yang et al., 2019). Потеря любого из этих факторов в яичниках нарушает репрессию TGS и транспозонов, но то, как они рекрутируются в локусы транспозонов и взаимодействуют в репрессии мишеней, остается неясным (Czech et al., 2013; Handler et al., 2013; Muerdter et al., 2013; Мугат и др., 2020; Ninova et al., 2020; Сиенски и др., 2015; Ян и др., 2019; Ю. и др., 2015).

Недавняя работа раскрыла комплекс, состоящий из Panoramix (Panx), ядерного фактора экспорта 2 (Nxf2) и связанного с NTF2 экспортного белка 1 (Nxt1), названного PICTS (также известного как SFiNX), который функционирует ниже Piwi и выше хроматина. модификация механизмов для воздействия на TGS (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019; Murano et al., 2019; Sienski et al., 2015; Ю. и др., 2015; Чжао и др., 2019). Хотя и Panx, и Nxf2 могут вызывать репрессию транскрипции при искусственном привлечении к репортерам, связь с эпигенетическими модификаторами и активностью подавления транскрипции комплекса PICTS, по-видимому, находится внутри самого Panx (Batki et al. , 2019; Fabry et al., 2019) .

Здесь мы сообщаем, что высококонсервативная легкая цепь динеина LC8 / Cut-up (Ctp) является критическим фактором TGS и неотъемлемой частью комплекса PICTS. Ctp важен для репрессии транспозонов как в соматическом, так и в зародышевом компартментах яичников Drosophila и, подобно Panx и Nxf2, может вызывать подавление транскрипции, когда искусственно привязан к репортерному локусу.В отличие от Panx и Nxf2, функции которых специфичны для контроля транспозонов (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019; Murano et al., 2019; Sienski et al., 2015; Yu et al., 2015; Zhao et al., 2019), Ctp — это повсеместно экспрессируемый и незаменимый белок с широким спектром клеточных функций (Barbar, 2008; Jespersen & Barbar, 2020; Rapali, Szenes, et al., 2011). Впервые идентифицированный как компонент моторного комплекса динеина (King & Patel-King, 1995), Ctp, который сам по себе образует гомодимер, с тех пор, как было показано, функционирует как белок-концентратор димеризации, способствуя сборке и стабилизации многих динеиновых белков. независимые белковые комплексы (Barbar & Nyarko, 2014; Jespersen & Barbar, 2020).Мы показываем, что Ctp способствует димеризации комплекса PICTS посредством взаимодействия с двумя консервативными мотивами в Panx. В отсутствие Ctp Panx неспособен к самоассоциации и неспособен поддерживать молчание транспозонов. Взятые вместе, наши данные показывают, что Ctp-обеспечиваемая сборка комплексов PICTS более высокого порядка важна для образования и подавления гетерохроматина.

Результаты

Ctp ассоциируется с комплексом PICTS и необходим для контроля транспозонов

Ранее мы и другие показали, что Panx, Nxf2 и Nxt1 образуют комплекс, который действует ниже взаимодействия мишени Piwi, чтобы заглушить транспозоны на уровне транскрипции (Batki и другие., 2019; Fabry et al., 2019; Мурано и др., 2019; Чжао и др., 2019). В рамках этого исследования мы иммунопреципитировали GFP-меченные Panx и Nxf2 из лизатов яичников и идентифицировали ассоциированные белки с помощью масс-спектрометрии (Fabry et al. , 2019). Помимо известных компонентов комплекса PICTS, белок Cut-up (Ctp) был значительно обогащен в обоих экспериментах (рис. 1A) . Это был неожиданный результат, поскольку Ctp является членом семейства LC8 легких цепей динеина и компонентом моторного комплекса динеина.Более того, в отличие от Piwi, Panx и Nxf2, которые демонстрируют экспрессию, обогащенную яичниками, Ctp повсеместно экспрессируется (рис. 1B), и необходим для жизнеспособности, с мутациями потери функции в Drosophila , вызывающими эмбриональную летальность (Dick, Ray , Salz, & Chia, 1996). Семейство легких цепей динеина LC8 было впервые идентифицировано как компонент цитоплазматического динеина (King & Patel-King, 1995), и это семейство чрезвычайно хорошо консервативно, так как Ctp Drosophila отличается от своего ортолога млекопитающих всего на четыре аминокислоты ( Рисунок 1 — дополнение 1A) .С тех пор было показано, что эти белки участвуют в ряде динеин-независимых процессов, включая регуляцию транскрипции, позиционирование митотического веретена и апоптоз (Barbar, 2008; S. Clark et al., 2018; Jurado et al., 2012; Rapali. , Szenes, et al., 2011; Singh et al., 2020; Slevin, Romes, Dandulakis, & Slep, 2014; Zaytseva et al., 2014), что побудило нас исследовать потенциальную роль Ctp в подавлении транспозонов.

Рис. 1. Ctp ассоциируется с комплексом PICTS и необходим для подавления транспозонов в зародышевой линии мух.

(A) График обогащения, показывающий кратность изменения сложных белков PICTS и Piwi в IP GFP-Panx и GFP-Nxf2 по сравнению с контролем (n = 4). (B) Тепловая карта, показывающая уровни экспрессии ctp, cdlc2, panx, nxf2, nxt1 и piwi в различных тканях Drosophila . (C) Столбчатая диаграмма, показывающая кратные изменения уровней РНК яичников гена домашнего хозяйства act5c и специфичных для зародышевой линии транспозонов HeT-A и лопуха при нокдауне зародышевой линии указанного гена, как измерено с помощью qPCR.(*) p <0,05 (**) p <0,001 (непарный t-критерий). Планки погрешностей указывают на стандартное отклонение (n = 4). (D) Вулкан график, показывающий кратное изменение и значимость (скорректированное значение p) генов и транспозонов между ctp, GLKD и контролем, как измерено с помощью RNA-seq. TE, сменный элемент. (E) То же, что и в D , но сравнивая panx GLKD с control. (F) Иммунофлуоресцентные изображения, показывающие локализацию Piwi в яичниках после нокдауна указанного гена.Масштабная линейка = 10 мкм M. (G) Изображения, показывающие морфологию яичников, визуализированную окрашиванием DAPI после нокдауна указанного гена. Шкала шкалы = 1 мм.

Подобно Panx, специфичный для зародышевых клеток shRNA-опосредованный нокдаун ctp привел к значительной дерепрессии специфичных для зародышевой линии транспозонов HeTA и лопуха , по результатам количественной ПЦР (Рисунок 1C) . Чтобы оценить глобальные транскрипционные изменения при потере Ctp, мы выполнили секвенирование РНК (RNA-seq) из яичников из этих нокдаунов и сравнили экспрессию транспозонов и генов с нокдауном white ( w ).Мы обнаружили, что 49 из 69 (71,0%) семейств транспозонов были значительно активированы после истощения Ctp (Рисунок 1D) по сравнению с 19,4% для Panx (Рисунок 1E) , что указывает на то, что потеря Ctp нарушает репрессию транспозонов в зародышевой линии. . В отличие от Panx (63 гена или 0,5%), потеря Ctp также сильно повлияла на экспрессию генов: 2 578 (или 16,2%) генов изменились более чем в 4 раза по сравнению с контролем. Ядерная локализация Piwi не была затронута при нокдауне ctp зародышевой линии (Рисунок 1F и Рисунок 1 — приложение к рисунку 1B) , а уровни piRNA были только умеренно изменены в соматических клетках яичников, лишенных Ctp (Рисунок 1 – рисунок Приложение 1C) , оба соответствуют нокдауну белка, участвующего в TGS. Однако истощение Ctp в зародышевой линии привело к серьезному нарушению морфологии яичников с отсутствием у большинства овариол яичных камер поздней стадии (рис. 1G) , что, вероятно, отражает потребность в этом белке для ряда клеточных процессов (Barbar, 2008; Rapali, Szenes, et al., 2011). В самом деле, самки с Ctp, истощенными в зародышевых клетках, неспособны откладывать яйца, тогда как нокдаун зародышевой линии panx приводит к стерильности с минимальным эффектом на кладку яиц (Рисунок 1 — приложение к рисунку 1D) .

Учитывая нарушение архитектуры ткани и широко распространенные изменения экспрессии генов, вызванные истощением Ctp in vivo , мы обратились к культивированным соматическим клеткам яичников (OSC), которые несут функциональный Piwi-зависимый путь молчания ядерных транспозонов и обеспечивают надежный в vitro модель соматического компартмента яичника (Saito et al., 2009). Мы выполнили РНК-seq из клеток, лишенных Ctp посредством siRNA-опосредованного нокдауна, и сравнили экспрессию гена и транспозона с siGFP и siPanx контролями (Рисунок 2A, B) . В целом, 37 семейств транспозонов были сильно активированы (log 2 кратное изменение> 2, RPKM> 1, скорректированное значение p <0,05) после нокдауна ctp , включая оба сом-специфичных транспозона, такие как gypsy и 297 , и транспозоны, активные как в зародышевой линии, так и в соме, такие как 412 и кровь (рис. 2A, C, F) . Этот эффект значительно сильнее по сравнению с нокдауном panx, nxf2 или piwi (Рисунок 2B, C) , что, вероятно, отражает тот факт, что Ctp участвует в ряде важных клеточных процессов, тогда как Panx и Nxf2 имеют путь piRNA. -специфические функции (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019). В соответствии с этим и согласуется с фенотипом зародышевой линии, нокдаун ctp оказал большее влияние на экспрессию нетранспозонных генов, при этом 354 из 15644 (2,7%) генов значительно изменились по сравнению с 0,7%, 0,6% и 1,0%. для siPanx, siNxf2 и siPiwi соответственно (Рисунок 2D и Рисунок 2 — дополнение рисунка 1A) . Примечательно, что во всех четырех нокдаунах до половины активированных генов располагаются в геномных местах с их промоторами в непосредственной близости от вставки gypsy, mdg1, blood, 297 или 412 (рисунок 2D и рисунок 2– приложение к рисунку 1A ) , предполагая, что некоторые из наблюдаемых изменений экспрессии генов являются плейотропным эффектом, вызванным нарушением молчания транспозонов.Более того, анализ этих генов с точки зрения кратности изменения показал, что наиболее высоко регулируемые гены с большей вероятностью будут находиться в геномной близости к транспозону, чем те, которые слабо изменяются (рис. 2E) , что дополнительно указывает на то, что нарушение пути piРНК нарушается. приводя к наиболее сильным изменениям экспрессии генов, наблюдаемым при этих нокдаунах. Таким образом, хотя нокдаун ctp приводит к ожидаемым эффектам на экспрессию генов, мы обнаружили, что наибольшие изменения экспрессии в OSCs, лишенных Ctp, связаны с транспозонами, и поэтому контроль транспозонов, по-видимому, является важной ролью Ctp в этом типе клеток.

Рисунок 2. Ctp необходим для подавления транспозонов и отложения h4K9me3 в локусах транспозонов в соматических клетках яичников.

(A) График МА , показывающий уровень экспрессии в зависимости от кратности изменения (FC) для генов и транспозонов в siCtp против siGFP . Красные пунктирные линии обозначают log 2 FC = 2. TE, сменный элемент. (B) То же, что и A , но для сравнения siPanx и siGFP . (C) Столбиковая диаграмма, показывающая количество семейств мобильных элементов (TE), репрессированных более чем в 4 раза при указанных нокдаунах (RPKM> 1). (D) Гистограмма, показывающая количество неправильно экспрессируемых генов в указанных нокдаунах, выделяя те, промоторы которых находятся рядом со вставкой gypsy, mdg1, 297, крови или 412 (RPKM> 1). (E) Гистограмма, показывающая долю генов с промоторами в непосредственной близости от вставки gypsy, mdg1, 297, крови или 412 в соответствии с их кратностью изменения в siCtp по сравнению с siGFP (RPKM> 1 ). TE, сменный элемент. (F) Графики покрытия, показывающие нормализованные чтения из RNA-seq по консенсусной последовательности транспозона gypsy для указанных нокдаунов OSC. (G) То же, что и в F , но показаны графики покрытия чтения h4K9me3 ChIP-seq для указанных нокдаунов OSC. Чтения из входных библиотек показаны ниже. (H) Тепловые карты (вверху) и мета-профили (внизу), показывающие сигнал h4K9me3 ChIP-seq в 25-килобайтных вставках 119 gypsy в OSC (отсортированных по убыванию сигнала в контроле siGFP ). (I) То же, что и H для сигнала h4K4me2. (J) Коробчатая диаграмма , показывающая кратное изменение сигнала h4K9me3 и h4K4me2 (cpm) при указанном нокдауне по сравнению с сигналом siGFP в h4K9me3 и сигнале h4K4me2 в геномных бинах размером 1 т.п.н., окружающих сайты вставки регулируемых транспозонов (TEs; gypsy, mdg1, 297, blood и 412 ) в OSCs. ** означает> 2-кратную разницу в медиане и p <0,001 (критерий суммы рангов Вилкоксона).

Отложение h4K9me3 в локусах, регулируемых Piwi, зависит от Ctp

Учитывая высокие уровни депрепрессии транспозонов, наблюдаемые при истощении Ctp, мы выполнили иммунопреципитацию хроматина с последующим секвенированием (ChIP-seq) для h4K9me3 и h4K4me2, чтобы оценить, увеличились ли транскрипционный выход транспозонов коррелировал с изменениями в среде хроматина.Потеря Ctp привела к серьезному снижению метки h4K9me3 в репрессированных последовательностях транспозонов, включая gyspy и 297 , аналогично тому, что наблюдалось на siPanx, siNxf2 или siPiwi , что коррелировало с увеличением чтения покрытие от RNA-seq (Рисунок 2F, G и Рисунок 2 — приложение к рисунку 1B, C) . Анализ сигнала h4K9me3, окружающего вставки gypsy и 297 в геноме OSC, показал, что истощение Ctp привело к почти полной потере покрытия h4K9me3 из области генома, окружающей каждую вставку (рис. 2H и рис. 2 — дополнение к рисунку 1D). ) .Более того, это коррелирует с увеличением охвата h4K4me2, метки, указывающей на активную транскрипцию, через те же самые вставки (Рисунок 2I и Рисунок 2– приложение к рисунку 1E) .

При рассмотрении сигнала ChIP-seq вокруг всех вставок gypsy, mdg1, крови, 297 или 412 в геном OSC, мы обнаружили значительное обогащение h4K4me2 и истощение h4K9me3 при нокдауне компонентов комплекса PICTS, в то время как контрольные области (окружающие незатронутые транспозоны и гетерохроматические области на хромосоме 4) были затронуты лишь незначительно (рис. 2J) .Этот эффект проиллюстрирован при рассмотрении вставки gypsy в ген , расширенный ( ex ) на хромосоме 2L ( Рисунок 2 — приложение к рисунку 1F ), что показывает, что повышенный выход транскрипции по этому локусу коррелирует с потерей h4K9me3 и приобретение h4K4me2 вокруг сайта вставки gypsy . В совокупности эти анализы показывают, что Ctp вносит вклад в репрессивные состояния хроматина, наблюдаемые в локусах транспозонов в OSCs, указывая на то, что Ctp необходим для TGS.

Ctp является добросовестным эффектором котранскрипционного сайленсинга генов

Наши результаты показывают участие Ctp в котранскрипционном подавлении генов мобильных элементов (TE) в зародышевой линии и соматических клетках яичника. В соответствии с функцией замалчивания хроматина, 3xFLAG-Ctp обнаруживает как цитоплазматическую, так и ядерную локализацию в OSCs, которая не нарушается при нокдауне panx (Рисунок 3A и Рисунок 3 — приложение 1A) . Эксперименты по фракционированию OSCs, обработанных siGFP , подтвердили присутствие Ctp как в ядерном, так и в цитоплазматическом компартментах, при этом нокдаун panx не влиял на распределение или стабильность эндогенного Ctp (Рисунок 3B) .Однако истощение Ctp привело к снижению уровней белка Panx, хотя и не так сильно, как наблюдалось после нокдауна nxf2 (Рисунок 3C) , как сообщалось ранее (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019 ). Учитывая это, мы отмечаем, что эффекты подавления молчания транспозонов, наблюдаемые при нокдауне ctp в OSCs, могут частично быть следствием дестабилизации Panx.

Рисунок 3. Ctp участвует в котранскрипционном замалчивании генов транспозонов.

(A) Иммунофлуоресцентные изображения, показывающие субклеточную локализацию 3xFLAG-Ctp, временно трансфицированных в OSC после указанного нокдауна.Масштабная линейка = 5 мкм M. (B) Вестерн-блоттинг для цитозольных белков (тубулин), ядерных белков (ламин и His3) и Ctp после субклеточного фракционирования OSC, обработанных указанной миРНК. (C) Вестерн-блоттинг, показывающий уровни белка Panx и Ctp в OSC после указанного нокдауна. Относительный уровень белка Panx по сравнению с siGFP и нормализованный по экспрессии тубулина показан ниже. (D) Вверху: схематическое изображение репортерной системы привязки РНК.Представляющие интерес белки (POI), слитые с белком λN, рекрутируются на репортерную мРНК (экспрессируемую с промотора убиквитина D. simulans ) через сайты BoxB в 3’UTR. Внизу: гистограммы, показывающие уровень белка HA-ZsGreen относительно контроля λN-Renilla при экспрессии λN-Panx или λN-Ctp. (**) p <0,001 (непарный t-критерий). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3). (E) Вверху: схематическое изображение репортерной системы привязки ДНК. Представляющие интерес белки (POI), слитые с ДНК-связывающим доменом LacI, рекрутируются в репортерный локус через сайты LacO выше D.simulans промотор убиквитина. Внизу: гистограммы, показывающие уровень белка HA-ZsGreen относительно контроля LacI-Renilla при экспрессии LacI-Panx или LacI-Ctp. (**) p <0,001 (непарный t-критерий). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3). (F) Иммунофлуоресцентные изображения, показывающие экспрессию Piwi по сравнению с экспрессией репортера связывания ДНК в яичниках при специфической для зародышевой линии экспрессии LacI-Panx и LacI-Ctp. Контроль указывает на родительское происхождение, выражающее только репортер.ДНК визуализируется с помощью окрашивания DAPI. Масштабная линейка = 10 мкм M.

Отличительной чертой белков, участвующих в котранскрипционном замалчивании транспозонов, является их способность вызывать репрессию транскрипции при их искусственном рекрутировании в кодирующую ДНК или возникающую РНК, транскрибируемую из репортерных конструкций (Sienski et al., 2015; Ю. и др., 2015). Многие факторы хроматина и репрессоры транскрипции проявляют молчание при привязке к ДНК, включая гистоновые метилтрансферазы, такие как Egg, и связанные с гетерохроматином белки, такие как HP1a (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019; Sienski et al., 2015). В то время как системы связывания ДНК обеспечивают прямой тест способности к подавлению транскрипции независимо от возникающей РНК, факторы, которые влияют на подавление ко-транскрипции в ответ на распознавание формирующейся РНК, также способны вызывать репрессию при искусственном связывании с РНК, а Panx, Nxf2 и Nxt1 — все вызывают активность сайленсинга в этом контексте (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019; Murano et al., 2019; Sienski et al., 2015; Yu et al., 2015; Zhao et al., 2019).

Чтобы исследовать прямую роль Ctp в TGS, мы использовали две репортерные системы, в которых представляющие интерес белки привязаны к РНК (через шпильки BoxB) или к ДНК (через сайты LacO) (Рисунок 3D, E) ( Fabry et al., 2019). Связывающие репортеры стабильно интегрированы в OSC, и способность интересующего белка к подавлению молчания оценивается путем оценки уровня белка HA-ZsGreen и уровней РНК после трансфекции слитого белка λN или LacI. Привязка λN-Panx к РНК индуцировала сильное молчание репортера как на уровне белка (Рисунок 3D и Рисунок 3 — приложение к рисунку 1B, C) , так и на уровне РНК (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1D) при сравнении к контролю λN-Renilla, как сообщалось (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019; Мурано и др., 2019; Сиенски и др., 2015; Ю. и др., 2015; Чжао и др., 2019). Трансфекция λN-Ctp также привела к репортерной репрессии на уровне, сравнимом с λN-Panx, при этом оставалось 28% белка ZsGreen и 29% растущего сигнала транскрипта относительно контроля λN-Renilla (Рисунок 3D и Рисунок 3 — приложение к рисунку 1B-D. ) , указывая на то, что Ctp также может функционировать как репрессор котранскрипции в OSCs. Более того, привязка Ctp к ДНК приводила к мощной репортерной репрессии в той же степени, что и привязка Panx (Рисунок 3E и Рисунок 3 — приложение к рисунку 1E, F) с 10% белка ZsGreen и 4% сигнала транскрипта ZsGreen, оставшимися по отношению к сигналу транскрипта ZsGreen. контроль.Кроме того, использование репортера связывания ДНК in vivo показало, что, как и в случае с Panx, привлечение ДНК Ctp приводит к сильной репрессии, что указывает на то, что Ctp также может функционировать как репрессор транскрипции в компартменте половых клеток яичника мухи (рис. 3F и рисунок 3 — дополнение к рисунку 1G) . Взятые вместе, эти данные указывают на то, что Ctp вносит вклад в котранскрипционную репрессию транспозонов.

Два консервативных мотива в Panx опосредуют взаимодействие с Ctp

Наши результаты предполагают, что Ctp является компонентом комплекса PICTS и истинным эффектором TGS.Чтобы понять, как Ctp способствует Piwi-зависимому контролю транспозонов, мы выполнили иммунопреципитацию 3xFLAG-Ctp из OSC и проанализировали восстановленные белки с помощью масс-спектрометрии. Это подтвердило взаимодействие между Ctp и Panx, Nxf2 и Nxt1 (Рисунок 4A, Рисунок 4-дополнение к рисунку 1A, B и Рисунок4-исходные данные 1) . Следует отметить, что мы не нашли Piwi enriched (Рисунок 4-рисунок, приложение 1B) , совместимого с результатами иммунопреципитации других членов PICTS (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019). Эксперименты по коиммунопреципитации в OSCs показали, что взаимодействие между Ctp и Panx опосредуется карбоксиконцевой областью Panx (рис. 4B) . Мутант Panx, лишенный второй области спиральной спирали (Panx ΔCC2 + deg ), которая не может взаимодействовать с Nxf2 (Fabry et al., 2019), все еще был способен связывать Ctp (Рисунок 4-рисунок, приложение 1C) , предполагая, что взаимодействие Panx-Ctp не зависит от Nxf2. Напротив, Ctp и Nxf2, как было обнаружено, ассоциировались только в присутствии Panx (Рисунок 4-рисунок, приложение 1D) , указывая на прямое взаимодействие между Ctp и Panx, при этом Panx служит платформой взаимодействия для компонентов комплекса PICTS.

Рисунок 4. Ctp связывается с PICTS через два высококонсервативных мотива в карбокси-концевой области Panx.

(A) График вулкана, показывающий обогащение по сравнению со значимостью для белков, идентифицированных масс-спектрометрией, которые очищаются совместно с 3xFLAG-Ctp из лизатов OSC по сравнению с контролем 3xFLAG-mCherry (n = 3). (B) Вестерн-блот-анализ на 3xFLAG-Ctp и выявил конструкции, меченные НА, после иммунопреципитации FLAG из OSC. IN = вход (1x), UB = несвязанный (1x) и IP = иммунопреципитат (10x). (C) Диаграмма Венна для белков, значительно обогащенных Ctp IP-MS, указывающая на перекрытие между ранее описанными Ctp-взаимодействующими и белками, содержащими мотив TQT. (D) Логотип последовательности, представляющий наиболее распространенный мотив распознавания Ctp, обнаруженный в белках, очищаемых совместно с Ctp из OSC. Высота буквы представляет собой относительное обогащение аминокислот, а буквы окрашены в соответствии со свойством аминокислоты (положительный заряд = фиолетовый, отрицательный заряд = желтый, полярный = зеленый и гидрофобный = черный). (E) Схема, показывающая известные функциональные домены Panx наряду с предсказанием беспорядка и вторичной структуры. Консервация мотива TQT у видов Drosophila и мутации, сделанные в этих последовательностях, указаны на вставке. (F) То же, что и B . IN = вход (1x), UB = несвязанный (1x) и IP = иммунопреципитат (10x). (G) Термограммы калориметрии изотермического титрования для Ctp с Panx, Panx TQT # 1 , Panx TQT # 2 и Panx 2xTQT .Схема, показывающая фрагмент Panx, используемый в каждом эксперименте, указана выше. Красный пунктирный контур указывает на мутацию мотива TQT. (H) Столбчатая диаграмма, показывающая относительные кратные изменения уровней мРНК OSC сома-специфического транспозона gypsy после нокдауна panx и повторной экспрессии указанной спасательной конструкции. (*) p <0,05 (непарный t-критерий). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3). (I) Гистограммы, показывающие уровень белка HA-ZsGreen относительно контроля λN-Renilla после привязки λN-Panx или λN-Panx 2xTQT к РНК-репортеру в OSC.(*) p <0,05 (непарный t-критерий). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3).

В дополнение к компонентам PICTS мы идентифицировали еще 56 белков, которые были значительно обогащены (log 2 FC> 2 и p <0,01) в масс-спектрометрии с иммунопреципитацией Ctp (IP-MS). Из них 20 были описаны ранее (рис. 4A, C) , включая короткое крыло промежуточной цепи динеина (sw) и фактор транскрипции Asciz (S. Clark et al., 2018; Jurado et al., 2012; Lo , Naisbitt, Fan, Sheng, & Zhang, 2001; Makokha, Hare, Li, Hays, & Barbar, 2002; Nyarko, Hare, Hays, & Barbar, 2004; Zaytseva et al., 2014). Анализ партнеров Ctp у ряда видов показал, что Ctp связывает линейную последовательность распознавания, обнаруженную во внутренне неупорядоченных белковых регионах (Jespersen et al., 2019; Makokha et al., 2002; Rapali, Radnai, et al., 2011). Эта последовательность, в дальнейшем называемая мотивом TQT, состоит из восьми аминокислот, заякоренных высококонсервативным триплетом, чаще всего остатком глутамина, зажатым между двумя треонинами (Jespersen et al., 2019; Rapali, Radnai, et al., 2011). Среди всех 59 белков, обогащенных Ctp IP-MS, мы идентифицировали 32 белка с одним или несколькими предполагаемыми мотивами TQT (рис. 4C, D и дополнительный файл 1) , используя инструмент прогнозирования связывающей последовательности LC8Pred (Jespersen et al., 2019). Поразительно, что это включало две высоко оцениваемые и консервативные последовательности узнавания на С-конце Panx (рис. 4E) .

Чтобы проверить, связан ли какой-либо из предполагаемых мотивов TQT в Panx с помощью Ctp, мы сгенерировали мутанты Panx, в которых либо первый (Panx TQT # 1 ), либо второй (Panx TQT # 2 ), либо оба мотива ( Panx 2xTQT ) были нарушены точечными мутациями в якорном триплете (рис. 4E) . Panx 2xTQT больше не содержал никаких предсказанных последовательностей связывания Ctp при поиске с использованием LC8Pred.Анализ коиммунопреципитации в OSCs показал, что и Panx TQT # 1 , и Panx TQT # 2 обладают пониженной способностью взаимодействовать с Ctp, но только мутация обоих сайтов полностью отменяет взаимодействие (Рисунок 4F) . Panx 2xTQT все еще мог взаимодействовать с Nxf2, подтверждая, что взаимодействия Panx с Nxf2 и с Ctp независимы (Рисунок 4-рисунок, дополнение 1E) .

Чтобы исследовать, заняты ли оба сайта TQT в Panx одновременно Ctp, мы выполнили изотермическую калориметрию титрования (ITC) для анализа стехиометрии и кинетики связывания взаимодействия Panx-Ctp in vitro .ITC для фрагмента Panx, охватывающего область взаимодействия Nxf2 (CC2) (Fabry et al., 2019), ранее аннотированный degron (Batki et al., 2019) и оба мотива TQT подтвердили, что оба сайта связаны с Ctp in vitro (Рисунок 4G, Рисунок 4-рисунок, дополнение 1F и дополнительный файл 2) . Фрагмент Panx дикого типа связывал Ctp со стехиометрией Panx: Ctp 1: 2 и с высокой аффинностью (K D = 0,1 μ M ± 0,01 μ M) (рисунок 4G) .В соответствии с анализом коиммунопреципитации, связывание Ctp полностью отменяется после мутации обоих мотивов TQT (фигура 4G) . ITC для одного и того же фрагмента, содержащего мутации в любом из мотивов TQT по отдельности, показал, что каждый сайт демонстрирует связывание Ctp отдельно при соотношении Panx: Ctp 1: 1 (фигура 4G) . Оба сайта прочно связываются с Ctp, хотя первый сайт связан с более высоким сродством, чем второй (K D = 0,7 μ M ± 0,10 μ M и K D = 0.2 μ M ± 0,06 μ M при мутации TQT # 1 и TQT # 2 соответственно). Эти данные согласуются с нашим анализом коиммунопреципитации в OSCs, который обнаружил, что мутация TQT # 1 сильнее влияет на взаимодействие Panx и Ctp, чем мутация TQT # 2 (Рисунок 4F) . В целом, это поддерживает модель, в которой мотивы TQT связаны кооперативно, и наблюдалась у других партнеров по связыванию Ctp с двумя сайтами узнавания в непосредственной близости (Hall, Karplus, & Barbar, 2009; Nyarko, Song, Novacek, Zidek, & Barbar. , 2013).

Panx зависит от Ctp для поддержки молчания транспозонов

Выявив точечные мутации в Panx, которые специфически нарушают связывание Ctp, мы использовали мутант Panx 2xTQT для исследования специфичной для комплекса PICTS функции Ctp, минуя плейотропные эффекты, вызванные ctp нокдаун. Истощение Panx в OSCs приводило к дерепрессии gypsy , которая могла быть спасена путем экспрессии siRNA-устойчивого Panx дикого типа (Рисунок 4H) .Panx 2xTQT не смог спасти репрессию gypsy в клетках, лишенных эндогенного Panx (Рисунок 4H) , несмотря на то, что демонстрирует сопоставимые уровни экспрессии (Рисунок 4-рисунок, дополнение 1G) и локализуется в ядре (Рисунок 4-Рисунок дополнение 1H) , подразумевая, что Ctp необходим для Panx, чтобы управлять молчанием транспозонов. Как было предсказано на основании более высокого сродства связывания Ctp с TQT # 1 (фиг. 4G) , мутация этого сайта оказала более сильное влияние на способность Panx восстанавливать молчание транспозонов, чем мутация TQT # 2 (фиг. 4H) .Интересно, что это коррелирует с большей сохранностью TQT # 1 у Drosophila видов (Figure 4E) . В соответствии с неспособностью репрессировать транспозоны, Panx 2xTQT также не смог вызвать молчание репортера связывания РНК в OSCs (рисунок 4I и рисунок 4-рисунок, приложение 1I, J) , предполагая, что взаимодействие с Ctp необходимо для подавления молчания на принудительное рекрутирование целевой РНК. Наконец, сравнение IP-MS для Panx с Panx 2xTQT в OSC показало, что эффект мутации высокоспецифичен.Мы не обнаружили значительных изменений во взаимодействии с белками этих конструкций, только Ctp значительно истощен в иммунопреципитации Panx 2xTQT (Рисунок 4 — дополнение 1K и Рисунок 4 — исходные данные 1) . Наши данные показывают, что Panx напрямую взаимодействует с Ctp через два консервативных мотива на С-конце Panx. В отсутствие Ctp Panx все еще ассоциируется с другими членами PICTS и локализуется в ядре, но не может поддерживать репрессию транспозонов, указывая тем самым, что Ctp играет специфическую роль в PICTS-направленных TGS.

Ctp индуцирует молчание через Panx

Drosophila S2 клетки не экспрессируют функциональный путь piRNA, хотя они действительно экспрессируют несколько белков, участвующих в TGS в разной степени (Рисунок 5A) . Мы рассудили, что мы могли бы использовать клетки S2 в качестве альтернативного контекста, в котором можно исследовать лежащие в основе механизмы, посредством которых выбранные компоненты PICTS взаимодействуют, чтобы вызвать репрессию транскрипции. Используя анализ репортерного связывания ДНК, мы обнаружили, что Panx, Nxf2, Ctp и Egg, но не Piwi, были способны вызывать репрессию при рекрутировании в репортерный локус в клетках S2 (Рисунок 5B и Рисунок 5, приложение 1A, B ) .Чтобы подтвердить, что механизм репрессии транскрипции точно воспроизводится в этом типе соматических клеток, мы выполнили ChIP-seq для h4K9me3 и h4K4me2 в клетках, трансфицированных LacI-Panx. В качестве положительного контроля отложения h4K9me3 в репортерном локусе мы использовали яйцо метилтрансферазы h4K9. По сравнению с контролем LacI-Renilla связывание как LacI-Panx, так и LacI-Egg привело к значительному накоплению h4K9me3 в репортерной последовательности и одновременному снижению охвата h4K4me2 (фиг. 5C) .Это демонстрирует, что, как и в случае OSCs, Panx-индуцированное подавление транскрипции в клетках S2 коррелирует с образованием репрессивной среды хроматина.

Рисунок 5. Ctp вызывает молчание через Panx.

(A) Вестерн-блоттинг, показывающий относительный уровень Piwi, Panx и Ctp в клетках S2 по сравнению с OSC. Тубулин использовали в качестве контроля нагрузки. (B) Гистограммы, показывающие уровень белка HA-ZsGreen относительно контроля LacI-Renilla после привязки указанного LacI-меченного белка к ДНК-репортеру в клетках S2.(*) p <0,05 (**) p <0,001 (непарный t-критерий). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3). (C) Покрытие сигнала ChIP-seq h4K9me3 (в центре) и h4K4me2 (внизу) с соответствующим входом через репортерный локус привязки ДНК. Схема репортера показана вверху, а дорожка сопоставления показана ниже. (D) То же, что и в A с избыточной экспрессией Panx или Panx 2xTQT указано. Отношение плазмиды LacI-Ctp к HA-Panx составляет от 1: 1 до 16: 1 и обозначено черной шкалой.(*) p <0,05 и n.s. = не значимо (непарный t-критерий). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3). (E) Гистограммы, показывающие уровень белка HA-ZsGreen относительно контроля LacI-Renilla после привязки LacI-Panx или LacI-Panx 2xTQT к ДНК-репортеру. n.s. = не значимо (непарный t-критерий). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3).

Мы заметили, что способность Ctp вызывать молчание репортера в клетках S2 была значительно слабее, чем у Panx, с ~ 40% сигнала, остающимся после трансфекции LacI-Ctp по сравнению с ~ 10% для LacI-Panx (рисунок 5A и Рисунок 5-фигурного дополнения 1С) .Это было в отличие от контекста OSC, где оба белка индуцировали молчание в одинаковой степени (Figure 3E) . Мы предположили, что LacI-Ctp индуцирует сайленсинг посредством рекрутирования Panx и что способность Ctp заставить замолчать репортер клеток S2 ограничена более низкими уровнями эндогенно экспрессируемого Panx в клетках S2 по сравнению с OSCs (Рисунок 5A) . В подтверждение этого, сверхэкспрессия Panx, но не мутанта Panx 2xTQT с LacI-Ctp увеличивала уровень репрессии репортера в 4 раза, что приводило к подавлению, сравнимому с подавлением, вызываемым самим LacI-Panx (Рисунок 5D и Рисунок 5 -фигурное приложение 1С, Д) .Более того, корректировка коэффициента трансфекции плазмид для титрования уровня сверхэкспрессии Panx показала, что этот эффект был дозозависимым, при этом более низкие уровни экспрессии Panx коррелировали с более слабым эффектом сайленсинга (Рисунок 5D и рисунок 5-рисунок в приложении 1C, D) . Чтобы проверить, зависит ли Panx от последующего рекрутирования Ctp для индукции эпигенетического молчания, мы привязали LacI-Panx 2xTQT к ДНК в клетках S2. Panx, который не может взаимодействовать с индуцированным Ctp сайленсингом в той же степени, что и Panx дикого типа, при рекрутировании непосредственно в локус ДНК (Рисунок 5E и рисунок 5-рисунок, дополнение 1E, F) , что указывает на то, что Panx не требует абсолютно Ctp чтобы вызвать репрессию транскрипции в этой обстановке.Это согласуется с предыдущими сообщениями, показывающими, что N-конец Panx, или Panx, неспособный взаимодействовать с Nxf2, может сам по себе вызывать молчание репортеров ДНК (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019). В целом, наши данные подтверждают модель, в которой Panx является первичным эффектором сайленсинга в комплексе PICTS, который обеспечивает рекрутирование, прямо или косвенно, модификаторов хроматина.

Ctp управляет самоассоциацией комплекса PICTS

Ctp сам по себе функционирует как гомодимер, который связывает два мотива TQT через две симметричные связывающие канавки и как таковой способствует самоассоциации своих взаимодействующих партнеров (Barbar, 2008; Jespersen & Barbar, 2020; Rapali, Szenes, et al., 2011). Мы наблюдали посредством коиммунопреципитации, что Panx самоассоциируется в OSCs (Рисунок 6A) , и поэтому мы спросили, опосредует ли Ctp это взаимодействие. В контрольных клетках HA-Panx, но не HA-GFP, выделяли при иммуноаффинной очистке 3xFLAG-Panx, однако нокдаун ctp существенно снижал коиммунопреципитацию дифференциально помеченных белков Panx (фиг. 6B) . Более того, дифференциально помеченные белки Panx 2xTQT не смогли ассоциироваться в OSCs (фиг. 6A) , тогда как мутация только первого мотива нарушалась, но была недостаточной для отмены взаимодействия (фиг. 6-фигура, приложение 1A) .Мутация TQT # 2 имела минимальный эффект на способность Panx димеризоваться в OSCs (Рисунок 6-рисунок, приложение 1A) , что согласуется с этим мутантом, в основном спасающим молчание транспозонов при эндогенном истощении Panx (Рисунок 4H) . Nxf2 также самоассоциирован в OSC в зависимости от его взаимодействия с Panx, поскольку он был нарушен делецией домена UBA, который опосредует взаимодействие Panx (Рисунок 6C) (Batki et al., 2019; Fabry et al. , 2019).

Рисунок 6.Ctp способствует сборке PICTS более высокого порядка посредством димеризации Panx.

(A) Вестерн-блоттинг для указанных конструкций, меченных FLAG и HA, после иммунопреципитации FLAG из OSC. IN = вход (1x), UB = несвязанный (1x) и IP = иммунопреципитат (10x). (B) Вестерн-блот-анализ для 3xFLAG-Panx и HA-GFP или HA-Panx после иммунопреципитации FLAG из OSC, обработанных либо siGFP , либо siCtp . IN = вход (1x), UB = несвязанный (1x) и IP = иммунопреципитат (10x). (C) То же, что и A . (D) и (E) Структурные модели, показывающие два пептида Panx (аминокислоты 449-485), связанные двумя гомодимерами Ctp. Для простоты единственная структура из ансамбля показана на D . Относительная подвижность пептида Panx при выравнивании по Ctp, связанному с первым мотивом TQT, показана в E . (F) То же, что и A . (G) Гистограммы, показывающие уровень белка HA-ZsGreen относительно контроля λN-Renilla после привязки указанной конструкции λN-Panx к репортеру РНК в OSC.(*) p <0,05 (**) p <0,01 (непарный t-критерий). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение (n = 3). (H) Модель, изображающая возможную сложную организацию PICTS, в которой Ctp управляет сборками более высокого порядка Panx-Nxf2-Nxt1 посредством димеризации C-конца Panx.

Мы смоделировали взаимодействие двойного TQT-пептида Panx с Ctp на основе известных структур гомодимеров Ctp, связанных с двумя внутренне неупорядоченными пептидами (рис. 6D, E) (Hall et al., 2009; Reardon et al., 2020). В этой модели каждый гомодимер Ctp связывает две цепи Panx путем связывания исключительно с одним сайтом узнавания на Ctp в каждой цепи, что приводит к соотношению Panx: Ctp 2: 4, что согласуется с нашими измерениями связывания с помощью ITC. Один пептид Panx связывается на каждой стороне интерфейса димеризации параллельным образом, и при связывании с помощью Ctp каждый мотив TQT принимает конформацию β-цепи в антипараллельном β-листе Ctp (фиг. 6D) . Короткий линкер между мотивами TQT увеличивает стерические препятствия между связанными димерами Ctp и приводит к минимальной гибкости между двумя сайтами, таким образом увеличивая жесткость пептида Panx (фиг. 6E) .В целом, наши объединенные данные указывают на то, что Ctp димеризует PICTS посредством своего взаимодействия с двумя связывающими мотивами на С-конце Panx. Приводит ли образование комплексного димера PICTS к сборке олигомеров более высокого порядка, как было показано для др. Ctp партнеров (Slevin et al., 2014), нуждается в дальнейших исследованиях.

Мы рассудили, что если основная функция Ctp в PICTS состоит в том, чтобы способствовать комплексной димеризации, и как таковой, если мутант Panx 2xTQT не смог вызвать молчание при привязке к РНК из-за нарушения самоассоциации, тогда мы могли бы спасти этот фенотип путем принудительной димеризации Panx 2xTQT через альтернативный домен.С этой целью мы слили Panx 2xTQT с C-концевой лейциновой застежкой из транскрипционного фактора GCN4 S. cerevisiae (Goldman, Neiswender, Veeranan-Karmegam, & Gonsalvez, 2019; Sladewski et al., 2018), который восстановил димеризация Panx 2xTQT в OSC (Рисунок 6F) . Поразительно, что привязка этой конструкции к РНК снова привела к репортерной репрессии (фиг. 6G и фиг. 6, добавление 6B, C) , указывая на то, что основная функция Ctp в PICTS состоит в том, чтобы способствовать димеризации комплекса.Таким образом, наши результаты показывают, что самосборка комплекса PICTS является фундаментальным требованием для подавления транскрипции посредством ассоциации возникающих РНК, и что это требование в конечном итоге выполняется за счет кооптации белка-концентратора димеризации Ctp.

Обсуждение

Недавняя работа выявила повторяющуюся тему включения существующих механизмов экспрессии генов в путь пиРНК яичников (Batki et al., 2019; ElMaghraby et al., 2019; Fabry et al., 2019; Kneuss et al., al., 2019; Мурано и др., 2019; Zhang et al., 2012; Чжао и др., 2019). Идентификация Ctp как важного компонента комплекса PICTS является другим примером и представляет собой ключевой шаг в нашем понимании piRNA-зависимого котранскрипционного сайленсинга генов. Исследования нескольких видов и различных макромолекулярных ансамблей выявили высококонсервативную функцию Ctp как белка-концентратора димеризации (Jespersen & Barbar, 2020) и высокоаффинное связывание Ctp с соседними сайтами в Panx (Рисунок 4F, G) аналогичным образом способствует димеризации PICTS (Фигура 6A-C) .Таким образом, наши данные указывают на модель, в которой карбокси-концевой домен Panx действует как каркас для сборки комплекса PICTS через его интерфейсы взаимодействия с Nxf2 (мостиком с Nxt1) и Ctp, в то время как сильно неупорядоченная аминоконцевая область является движущей силой. сила для подавления транскрипции через механизмы, которые остаются неразрешенными (Рисунок 6H) (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019).

Наши результаты демонстрируют ранее неизвестную потребность в димеризации комплекса PICTS для его выполнения транскрипционного сайленсинга, функции, которая стала возможной благодаря присутствию мотивов связывания Ctp в Panx.Некомпетентный к димеризации Panx неспособен вызвать молчание при искусственном рекрутировании на РНК (рис. 4I) , в то время как этот мутант может запускать молчание в той же степени, что и Panx дикого типа, если он привязан непосредственно к ДНК. Однако стоит отметить, что когда Panx доставляется в ДНК посредством слияния с LacI, связывание с диадным симметричным сайтом lacO эффективно доставляет слитый белок в виде тетрамера (Friedman, Fischmann, & Steitz, 1995; Lewis et al. , 1996). Это контрастирует с привязкой мономерного Panx в виде λN-слияния с сайтами BoxB на РНК.Примечательно, что искусственная димеризация Panx 2xTQT посредством слияния с лейциновой застежкой-молнией восстановила способность Panx к молчанию, когда он привязан к РНК, что согласуется с гипотезой о том, что функция, выполняемая Ctp в PICTS, ограничивается содействием сборке димерного комплекса. Следует отметить, что Panx, который дефектен в связывании Nxf2, также имеет пониженную способность к молчанию при привязке к РНК (Batki et al., 2019). Известно, что самоассоциация способствует связыванию РНК другими партнерами по связыванию Ctp (Goldman et al., 2019). Это может указывать на то, что взаимодействие интактного димерного комплекса с возникающим транскриптом является требованием для подавления молчания, потенциально посредством предотвращения диссоциации транскрипта и связанного комплекса от хроматина. Мы предполагаем, что закрепление растущих транскриптов транспозонов на хроматине гарантирует, что у эффекторов молчания есть время, чтобы вызвать гетерохроматинизацию конкретно в локусе, из которого транскрибируется транспозон.

На сегодняшний день все идентифицированные кофакторы Panx взаимодействуют через хорошо консервативные области на его С-конце (рис. 4B, E) (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019; Мурано и др., 2019; Чжао и др., 2019). Мы еще не идентифицировали белки, которые взаимодействуют с плохо консервативным, неупорядоченным N-концом, что может указывать на то, что механизмы, отличные от прямого рекрутирования кофакторов, вносят вклад в репрессию транскрипции. Примечательно, что олигомеризация HP1a более высокого порядка, для которой димеризация является предварительным условием, была связана с образованием разделенных фазами капель, которые опосредуют образование доменов гетерохроматина и опосредованное гетерохроматином молчание генов (Larson et al., 2017; Стром и др., 2017). Более того, существует множество характерных примеров разделения фаз жидкость-жидкость (LLPS), которые управляются РНК и их связывающими белками, включая те, которые связаны с хроматином (Li & Fu, 2019). Таким образом, мы могли предвидеть возможность того, что молекулярные связи между димерными PICTS и растущей РНК могут вносить вклад в LLPS-зависимый механизм молчания. Наконец, мы обнаружили, что искусственное привлечение Panx к ДНК в соматических клетках, в которых отсутствует функциональный путь piRNA, способно вызвать гетерохроматинизацию репортерного локуса (рис. 5B, C) , что позволяет предположить, что механизмы и механизмы, действующие ниже Panx, не являются гонадоспецифичный.

Истощение Ctp оказывает более сильное влияние на экспрессию транспозонов (и гена), чем истощение Panx как в зародышевой линии, так и в соматической ткани. Мы отмечаем, что участие Ctp в регуляции транспозонов может не ограничиваться его ролью в PICTS. Иммунопреципитация Ctp из OSC восстановила ряд регуляторов хроматина, включая Wde и Egg. Wde содержит предсказанный мотив распознавания Ctp и поэтому, вероятно, является истинным партнером Ctp, что подчеркивает широко распространенное присутствие Ctp в качестве белка-концентратора во множестве комплексов.Наконец, фактор транскрипции Asciz, который, как известно, регулирует экспрессию Ctp (Jurado et al., 2012; Zaytseva et al., 2014), также был обогащен IP-MS и ранее был связан с подавлением транспозонов зародышевой линии (Czech et al., 2013), открытие потенциально объясняется участием Ctp в этом механизме.

Последовательности узнавания Ctp хорошо законсервированы во всех предполагаемых ортологах Panx насекомых с некоторыми видами, такими как комнатная муха, Musca domestica , и комар, Aedes aegypti , несущие три предсказанных мотива по сравнению с двумя, обнаруженными у Drosophilids (рис. 6-значное приложение 1D) .Хотя для некоторых Ctp-партнеров одного сайта связывания достаточно, чтобы способствовать их самосборке, существует ряд примеров, когда несколько мотивов связываются кооперативно и вносят вклад в повышенную структурную организацию и жесткость неупорядоченного домена (С.А. Кларк, Джесперсен, Вудворд. , & Barbar, 2015; Reardon et al., 2020). Таким образом, комплексная димеризация может быть консервативным требованием для репрессии транскрипции у насекомых. Чистые гомологи или ортологи Panx не были идентифицированы за пределами насекомых, хотя piRNA-зависимое котранскрипционное молчание, вероятно, происходит во всем царстве животных.Когда будут идентифицированы функциональные эквиваленты Panx, будет очень интересно определить, указывает ли присутствие существенных мотивов TQT на то, что использование Ctp в качестве стратегии димеризации или мультимеризации является эволюционно древним или более поздним нововведением у насекомых.

Материалы и методы

Клонирование

Все конструкции клонировали с использованием набора для сборки ДНК NEBuilder HiFi (New England Biolabs E2621) в соответствии с инструкциями производителя. Все слитые белки HA, 3xFLAG, LacI и λN экспрессировались в клетках с промотора Drosophila act5c .Гены амплифицировали из кДНК, полученной из яичников. Оптимизированную по кодонам последовательность лейциновой молнии GCN4 (AAL09032.1) сливали с С-концом Panx 2xTQT с помощью ПЦР.

Культура клеток и трансфекция

OSC (подарок Микико Сиоми) культивировали, как описано (Niki, Yamaguchi, & Mahowald, 2006; Saito, 2014; Saito et al., 2009). Клетки S2 (Thermo Fisher Scientific; R69007) культивировали в среде Schneider’s Drosophila (Gibco) с добавлением 10% инактивированного нагреванием FBS (Sigma).Клеточные линии регулярно тестировались на заражение микоплазмами в домашних условиях. Нокдауны в OSC выполнялись, как описано ранее (Saito, 2014). Список последовательностей миРНК представлен в дополнительном файле 2 . Трансфекцию OSC проводили с использованием либо Xfect (Clonetech), либо набора V Cell Line Nucleofector (Amaxa Biosystems) с программой T-029, как описано (Saito, 2014). Эксперименты по спасению в ОСЗ проводились, как описано (Fabry et al., 2019; Munafo et al., 2019). Клетки S2 трансфицировали набором V Cell Line Nucleofector (Amaxa Biosystems) с использованием программы G-030, как описано (Batki et al., 2019). Стабильные клеточные линии получали путем котрансфекции репортерной плазмиды HA-ZsGreen плазмидой, экспрессирующей ген устойчивости к пуромицину под контролем металлотионинового промотора. Клетки с репортерными интеграциями отбирали обработкой пуромицином до получения стабильных линий, при этом клеточные линии впоследствии культивировали без пуромицина.

Мухи и обращение с ними

Всех мух содержали при 25 ° C на стандартной кукурузной муке или пропионовом корме. Для нокдаунов, специфичных для зародышевой линии, мы использовали запас, содержащий трансген UAS :: Dcr2 и драйвер nos :: GAL4 (описанный в (Czech et al., 2013)) и линий shРНК из Stock Center Bloomington Drosophila , скрещивания проводили при 27 ° C. Плодовитость самок с нокдаунами зародышевой линии оценивали путем скрещивания шести только что вылупившихся самок с пятью w 1118 самцов и подсчета количества яиц, отложенных за 3,5-дневный период, и куколок, которые развились через 7 дней. Для экспериментов по привязке мы скрестили акции, содержащие nanos -управляемый слитый белок LacI на хромосоме 2, с линией, экспрессирующей датчик привязки GFP-Piwi in vivo на хромосоме 3 (полученный из JB313394; Вена Drosophila Resource Center ).Подробная информация обо всех поголовьях мух, использованных в этом исследовании, приведена в дополнительном файле № 2 . Линия, экспрессирующая shРНК против Panx (в pVALIUM20), была получена, как описано (Ni et al., 2011).

Коиммунопреципитация из лизатов OSC

4 x 10 6 OSC подвергали нуклеофекции с помощью HA- и 3xFLAG-меченых конструкций (всего 5 мкг г) и собирали для анализа CoIP через 48 часов после трансфекции. Осадки клеток лизировали в 250 мкл мкл буфера для лизиса IP (Pierce) с добавлением полных ингибиторов протеаз (Roche) в течение 30 минут при 4 ° C, а затем центрифугировали при 21100 г в течение 10 минут при 4 ° C.Общий белок разбавляли до 1 мл буфером для лизиса IP и сохраняли 5% в качестве входных данных. Остальное инкубировали с 25 мкл мкл анти-FLAG M2 магнитных агарозных гранул (Sigma M8823) в течение ночи при 4 ° C. Несвязанные фракции собирали, и шарики промывали TBS 3 раза по 15 минут при 4 ° C. Белки элюировали из шариков в 20 мкл мкл 2X буфера для образцов NuPAGE (Invitrogen) путем кипячения при 90 ° C в течение 3 минут перед вестерн-блоттингом.

Экстракция РНК и анализ кПЦР

Осадки клеток или препарированные яичники лизировали в 1 мл TRIzol Reagent (Invitrogen) и экстрагировали РНК в соответствии с инструкциями производителя.1 мкМ г тотальной РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific) и подвергали обратной транскрипции с праймеров oligo (dT) 20 (Integrated DNA Technologies) с использованием набора для синтеза первой цепи SuperScript III (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя . Количественные эксперименты с ОТ-ПЦР (кПЦР) проводили с мастер-миксом Fast SYBR Green (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями производителя и анализировали на световом цикле для ПЦР в реальном времени QuantStudio (Thermo Fisher Scientific).Уровни транспозона и репортерного транскрипта ZsGreen рассчитывали с использованием метода ΔΔCT (Livak & Schmittgen, 2001), нормализовали до rp49 и количественно определяли кратные изменения относительно указанных контролей. Все использованные праймеры для кПЦР перечислены в дополнительном файле 2 .

Подготовка библиотеки RNA-seq

10 μ г РНК очищали с использованием набора RNeasy Miniprep Kit (Qiagen, 74106) в соответствии с инструкциями производителя. 1 мкМ г тотальной РНК использовали в качестве исходных данных для приготовления библиотеки, как описано (Fabry et al., 2019). Вкратце, поли (A) мРНК выделяли с использованием модуля магнитной изоляции NEBNext Poly (A) мРНК (NEB, E7490L). Библиотеки готовили с использованием набора NEBNext Ultra Directional Library Prep Kit для Illumina (NEB, E7420L) в соответствии с инструкциями производителя и количественно оценивали с помощью набора для количественного анализа библиотек KAPA для Illumina (Kapa Biosystems) и секвенировали на Illumina HiSeq 4000.

Анализ RNA-seq

Данные РНК-seq секвенировали как односторонние 50 п.н. с четырьмя повторами на условие.Для нокдауна nxf2, panx и piwi мы повторно проанализировали данные Фабри и его коллег (Fabry et al., 2019) с тремя повторами для каждого условия. Адаптеры для секвенирования (Illumina TruSeq) и низкокачественные основы были удалены с помощью Trim Galore! (v0.6.4) с «—stringency 6 -q 20». Bowtie (v1.2.1.1) (Langmead, Trapnell, Pop, & Salzberg, 2009) с «-S -n 2 -M 1 —best —strata —nomaqround —no-unal» использовался для исключения чтений соответствующие известные вирусы Drosophila (https: // obbard.bio.ed.ac.uk/data/Updated_Drosophila_Viruses.fas.gz, загружено 13 th января 2020 г.) с последующим выравниванием оставшихся считываний (извлеченных с использованием дополнительных параметров —max и —un) с набором 122 консенсусных последовательности транспозонов. Все оставшиеся чтения были также выровнены с эталонным геномом ( dm6 ) с использованием STAR (v2.7.3a) (Dobin et al., 2013) с «—outSAMtype BAM SortedByCoordinate —outMultimapperOrder Random —outSAMmultNmax 1 —outFilterMultimapNmax 1000 —winAnchorMultimapNmax 2000 —alignSJDBoverhangMin 1 —sjdbScore 3 ”и индекс генома, построенный с использованием NCBI RefSeq.

Для количественной оценки экспрессии генов и транспозонов мы использовали featureCounts с параметрами «-s 2 -O —largestOverlap -Q ​​50» и аннотации генов из Ensembl (выпуск 97) или аннотации, соответствующие каждой согласованной последовательности транспозонов. Это гарантировало, что учитывались только чтения, отображаемые однозначно на смысловую цепь. Анализ дифференциальной экспрессии был выполнен с помощью пакета DESeq2 (v1.26.0) (Love, Huber, & Anders, 2014) от R Bioconductor. Анализ экспрессии генов выполняли с использованием стандартного рабочего процесса DESeq2 с последующим уменьшением кратности log2 с использованием метода «ashr» (Stephens, 2017).Для анализа экспрессии транспозонов мы использовали размерные факторы из анализа экспрессии генов, тогда как оценки дисперсии и кратность изменения log2 были рассчитаны с использованием комбинированной матрицы подсчета генов и транспозонов для получения более надежных оценок. Значения RPKM были рассчитаны на основе метода надежного среднего отношения DESeq2 в функции «fpm». Ген или транспозон считали дифференциально экспрессируемым, если он имел> 4-кратную разницу в экспрессии, скорректированное значение p <0.05 и выражение> 1 RPKM. Чтобы ген считался близким к вставке транспозона, мы требовали, чтобы его TSS находился в пределах 10 т.п.н. выше и 15 т.п.н. от предполагаемой вставки. Кластерные сайты встраивания (расстояние между которыми составляет менее 5 т.п.н.) были исключены из этого анализа.

Модуль bamCoverage от deepTools (v3.3.2) (Ramirez et al., 2016) с «—binSize 1 —ignoreForNormalization chrM —normalizeUsing CPM —exactScaling —skipNonCoveredRegions —minMappingQuality 50» был использован для создания BigWig файлы для треков UCSC Genome Browser.Коэффициент масштабирования был включен для нормализации общего числа отображенных операций чтения. Графики покрытия консенсусных последовательностей транспозонов были созданы с использованием модуля genomecov от bedtools, подсчета всех считываний, отображаемых на смысловую цепь каждого транспозона, с последующей нормализацией cpm и построением графиков с использованием R. Список всех библиотек RNA-seq, сгенерированных и проанализированных в этом Исследование приведено в дополнительном файле № 4 .

Подготовка библиотеки малых РНК-seq

Для создания библиотек малых РНК размеры малых РНК размером 18-29 нуклеотидов были отобраны с помощью PAGE из 15 мкг мкг общей РНК из OSC.После очистки из геля библиотеки получали с использованием набора для подготовки библиотеки малых РНК CleanTag (TriLink, L-3206) в соответствии с инструкциями производителя. Библиотеки были количественно определены с помощью набора для количественного анализа библиотек KAPA для Illumina (Kapa Biosystems) и секвенированы на Illumina HiSeq 4000.

Анализ малых РНК-seq

Данные sRNA-seq были секвенированы как односторонние 50 п.н. с двумя повторами для каждого условия. Адаптеры для секвенирования (малая РНК Illumina) и большое количество рРНК были удалены с помощью программы Trim Galore! (v0.6.4), сначала с «—stringency 6 -q 0 —length 18», за которым следует «—stringency 30 -q 0 —length 18 -a TGCTTGGACTACATATGGTTGAGGGTTGTA». Bowtie (v1.2.3) с «-S -n 2 -M 1 —best —strata —nomaqround —no-unal» использовался для исключения картирования считываний с последовательностями вируса Drosophila с последующим выравниванием оставшихся считывает (извлекается с использованием дополнительных параметров —max и —un) набор из 122 согласованных последовательностей транспозонов. Распределения по размеру были рассчитаны с использованием всех считываний с картированием транспозонов и были одинаковыми для двух повторов.Список всех малых библиотек РНК-seq, сгенерированных и проанализированных в этом исследовании, приведен в дополнительном файле № 4 .

Иммуноокрашивание яичников

Яичники иссекали ледяным PBS, фиксировали в 4% PFA в течение 14 минут при комнатной температуре, пропитывали 3 раза по 10 минут промывками PBS + 0,3% тритоном (PBS-Tr) и блокировали блокирующим буфером. (PBS-Tr + 1% BSA) в течение 2 часов при комнатной температуре. Первичные антитела разводили в блокирующем буфере и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. После 3 х 10-минутных промываний при комнатной температуре в PBS-Tr вторичные антитела разводили в блокирующем буфере и инкубировали в течение ночи при 4 ° C.Образцы промывали 4 × 10 минут в PBS-Tr при комнатной температуре с добавлением DAPI (1: 5 000, Invitrogen D1306) во время третьей промывки. После 2 х 5-минутных промывок в PBS образцы были закреплены с помощью неувядающего средства ProLong Diamond (Thermo Fisher Scientific, P36961) и отображены на конфокальном микроскопе Leica SP8. Были использованы следующие антитела: анти-GFP (1: 1000; ab13970), анти-Piwi (1: 500) (Brennecke et al., 2007).

OSC Иммуноокрашивание

Трансфицированные OSC помещали на покрытые фибронектином покровные стекла в течение ночи.Клетки промывали PBS, фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA; Alfa Aesar) в течение 15 минут при комнатной температуре и промывали в PBS. Фиксированные клетки пермеабилизировали в PBS + 0,2% Triton X-100 в течение 10 минут, промывали PBS и затем инкубировали в PBS + 0,1% Tween-20 (PBST) + 1% BSA в течение 30 минут. Первичные антитела разводили в PBST + 0,2% BSA и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Покровные стекла промывали 3 раза по 5 минут в PBST, а затем инкубировали со вторичными антителами (Invitrogen), разведенными в PBST + 0.2% BSA в течение 1 часа при комнатной температуре. Покровные стекла промывали 3 раза по 5 минут в PBST, окрашивали DAPI (1: 1000, разведенный в PBS, Invitrogen D1306) в течение 10 минут, дважды промывали в PBS и закрепляли с использованием ProLong Diamond Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific, P36961). Были использованы следующие антитела: анти-НА (1: 1,1000; abcam ab18181), анти-FLAG (1: 1000; Cell Signaling Technology 14793S) и анти-ламин (1: 200; банк гибридом исследований развития ADL67.10).

Эксперименты по привязке и количественная оценка

Для экспериментов по привязке РНК и ДНК в OSC, 4 x 10 6 клеток со стабильной интеграцией репортерной плазмиды были подвергнуты нуклеофекции 5 мкг г плазмиды, экспрессирующей слитый белок λN или LacI как описано выше.Через 48 часов на клетки второй раз вводили импульс 5 мкл г той же плазмиды и позволяли расти в течение дополнительных 48 часов перед сбором для вестерн-блоттинга и анализа qPCR. Для экспериментов по связыванию в клетках S2 4 × 10 6 клеток со стабильной интеграцией репортерной конструкции связывания ДНК подвергали нуклеофекции с помощью 2 мкг г экспрессионной плазмиды слияния LacI. Через 72 часа клетки собирали для вестерн-блоттинга и количественной ПЦР.

Вестерн-блот

Осадки клеток лизировали в буфере RIPA (Pierce) с добавлением ингибиторов протеаз (Roche) и инкубировали в течение 20 минут при 4 ° C.После центрифугирования при 21000 g в течение 10 минут при 4 ° C концентрацию белка определяли количественно с использованием инфракрасного спектрометра Direct Detect (Merck). 10-20 мкл. г общего белка разделяли на денатурирующем геле NuPAGE 4-12% бис-трис (Thermo Fisher Scientific) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием сухого переноса iBLot2 (Invitrogen). Инкубации первичных антител проводили в течение ночи при 4 ° C, а инкубации вторичных антител в течение 45 минут при комнатной температуре. Основные используемые антитела: анти-FLAG (1: 2,500; Sigma F1804), анти-HA (1: 2,500; Cell Signaling Technology C29F4), анти-тубулин (1: 2,500; abcam ab18251), анти-тубулин (1: 2,500; abcam ab44928) анти-ламин (1: 200; банк гибридом исследований развития ADL67.10) анти-His3 (1: 1000; abcam ab10799), анти-DYNLL1 (1: 1000; abcam ab51603), анти-Piwi (1: 2,500) (Brennecke et al., 2007) и антитело против Panx (1: 20) (Sienski et al., 2015). Изображения были получены с помощью сканера Odyssey CLx (LI-COR).

Субклеточное фракционирование

Протокол субклеточного фракционирования был адаптирован Батьки и его коллег (Batki et al., 2019). Осадки клеток ресуспендировали в LB1 (10 мМ Трис-HCl pH 7,5, 2 мМ MgCl 2 , 3 мМ CaCl 2 с добавлением ингибиторов протеаз [Roche]) в течение 5 минут при 4 ° C с последующим центрифугированием (1000 g, 5 минут, 4 ° C).Супернатант сохраняли (фракция набухания), а осадок клеток ресуспендировали и инкубировали в LB2 (10 мМ Трис-HCl pH 7,5, 2 мМ MgCl 2 , 3 мМ CaCl 2 0,5% Nonidet P-40 и 10% глицерин. , с добавлением ингибиторов протеаз (Roche)) в течение 5 минут при 4 ° C с последующей стадией центрифугирования (1000 g, 5 минут, 4 ° C). Супернатант сохраняли (цитоплазматическая фракция), а осадок ядер ресуспендировали в LB3 (50 мМ Трис-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl 2 ,0.5% Triton X-100, 0,25% Nonidet P-40 и 10% глицерин с добавлением ингибиторов протеаз [Roche]). После 10-минутной инкубации на льду ядерный лизат обрабатывали ультразвуком в течение 3 циклов по 30 секунд ВКЛ / 30 секунд ВЫКЛ с использованием Bioruptor Pico (Diagenode) для обеспечения солюбилизации хроматина, а затем центрифугировали 18000 г в течение 10 минут. Фракцию набухания и цитоплазму объединяли и фракции анализировали вестерн-блоттингом.

Иммунопреципитация и масс-спектрометрия (IP-MS)

Для 3xFLAG-Ctp IP-MS 1 x 10 7 OSC засевали в чашки 10 см и трансфицировали 20 мкг г плазмиды экспрессии 3xFLAG-fusion (Xfect) на следующий день.Клетки собирали через 48 часов после трансфекции и лизировали в буфере для лизиса IP (Pierce) с добавлением ингибиторов протеаз (Roche) в течение 45 минут при 4 ° C. После центрифугирования при 16 500 g в течение 10 минут при 4 ° C лизаты (с сохранением 5% на входе) инкубировали с 50 мкм мкл магнитных агарозных гранул анти-FLAG M2 (Sigma M8823) в течение ночи при 4 ° C. Гранулы промывали трижды в течение 15 минут в буфере для лизиса IP, дважды в ледяном PBS и дважды в 100 мМ бикарбонате аммония перед отправкой на масс-спектрометрический анализ.Для 3xFLAG-Panx IP-MS, 1 x 10 7 OSC были подвергнуты нуклеофекции с помощью 5 μ g 3xFLAG-слитой экспрессии плюс 2 μ μ siRNA против эндогенного Panx. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции и фракционировали в соответствии с указанным выше протоколом. После обработки ультразвуком ядерную фракцию дополнительно обрабатывали в течение 30 минут бензоназой (50 Ед / мл) при 4 ° C с последующим центрифугированием. Ядерный лизат инкубировали с 50 мкл мкл магнитных агарозных гранул анти-FLAG M2 (Sigma M8823) в течение ночи при 4 ° C, промывали трижды по 15 минут в LB3, дважды в ледяном TBS (pH 8.0) и дважды в 100 мМ бикарбонате аммония перед отправкой на масс-спектрометрический анализ.

Масс-спектрометрический анализ

Образцы расщепляли трипсином и анализировали на масс-спектрометре Q-Exactive HF (Thermo Fisher Scientific). Файлы Spectral .raw обрабатывались с помощью поисковой системы SequestHT на Thermo ScientificTM Proteome Discoverer ™ 2.2. Поиск данных проводился в пользовательской базе данных, полученной из FlyBase («dmel-all-translation-r6.24») по критериям FDR на уровне спектра 1% с использованием Percolator (Вашингтонский университет).Узел для SequestHT включал следующие параметры: допуск по массе предшественника 20 м.д., допуск по массе фрагмента 0,02 Да, динамическими модификациями были окисление метионина (+15,995 Да), дезаминирование аспарагина и глутамина (+0,984 Да). Узел квантификатора ионов-предшественников (детектор признаков Minora) включал минимальную длину следа 5, макс. ΔRT изотопного рисунка 0,2 минуты. Консенсусный рабочий процесс включал в себя валидатор пептидов, белковый фильтр и счетчик. Для расчета интенсивностей ионов-предшественников в программе Feature mapper было установлено значение True для выравнивания RT с допуском по массе 10 ppm.Количество предшественников определяли количественно на основе интенсивности, а уровень достоверности для идентификации пептидов оценивали с использованием узла Percolator со строгим FDR при q-значении <0,01. Анализ данных об интенсивности количественного определения белка без метки проводился в R (версия 3.6.1) с использованием пакета qPLEXanalyzer (версия 1.2.0) (Papachristou et al., 2018). Для анализа использовались только уникальные пептиды, идентифицированные с высокой степенью достоверности (пептид FDR <1%) и сопоставление с одним белком. Интенсивность пептидов нормализовали между образцами с помощью среднего масштабирования в группах образцов.Для Ctp IP-MS пептиды, для которых более чем один образец целевого белка не имел измерений или для которых в целом отсутствовали более трех измерений, были отброшены. Для пептидов с одним пропущенным значением в контрольных образцах отсутствующие значения были вменены с использованием метода вменения усреднения ближайшего соседа (knn), представленного в R-пакете MSnbase (версия 2.10.1) (Gatto & Lilley, 2012). Для пептидов с более чем одним пропущенным значением в контрольных образцах отсутствующие значения были вычислены с использованием детерминированного минимального подхода, предусмотренного в MSnbase (версия 2.10.1). В случае Panx IP-MS пептиды, для которых все контрольные образцы не имели измерений или для которых более 1 образца целевого белка не имели измерений, были отброшены. Затем оставшиеся пропущенные значения были рассчитаны с использованием метода вменения усреднения ближайшего соседа (knn), представленного в пакете R MSnbase (версия 2.10.1) (Gatto & Lilley, 2012). Данные по пептидам суммировали до уровня белка путем суммирования интенсивностей для всех пептидов. Затем был проведен дифференциальный анализ путем линейного моделирования с использованием методов на основе лиммы, предоставляемых пакетом qPLEXanalyzer.Множественная тестовая коррекция значений p применялась с использованием метода Benjamini & Yekutieli для контроля FDR (Benjamini, Drai, Elmer, Kafkafi, & Golani, 2001).

Идентификация TQT и создание логотипа последовательности

Значительно обогащенные белки (log 2 FC> 2, p <0,01) были исследованы в LC8Pred (Jespersen et al., 2019) для выявления предполагаемых мотивов TQT (оценка аминокислот LC8Pred> 12 ). Окончательный список последовательностей (длиной 8 аминокислот) был использован в качестве входных данных для создания логотипа последовательности с использованием https: // weblogo.berkeley.edu/logo.cgi с параметрами по умолчанию.

Выравнивания последовательностей и структурные предсказания

Доменная структура Panx была аннотирована в соответствии с предыдущими исследованиями (Batki et al., 2019; Fabry et al., 2019). Список видов насекомых-ортологов Panx был адаптирован из работы Батьки с соавторами (Batki et al., 2019). Последовательности были выровнены с помощью Mafft (с параметрами по умолчанию) и визуализированы в Jalview (v.2.11.1.2). Вторичные структурные элементы были предсказаны с помощью SPIDER3 (Heffernan, Yang, Paliwal, & Zhou, 2017), а нарушения — с помощью NetSurfP2 (Klausen et al., 2019), доступ к которому осуществлялся через quick2d (Zimmermann et al., 2018). Мотивы TQT были предсказаны в LC8Pred (Jespersen et al., 2019). Структурные модели были созданы путем фиксации мотива взаимодействия и координат Ctp с теми, которые наблюдаются в файле банка данных белков 2P2T (Benison, Karplus, & Barbar, 2007), и выполнения молекулярной динамики в XPLOR-NIH.

Экспрессия и очистка белка

Бактериальные культуры для экспрессии белков выращивали в лизогенном бульоне (LB) при 37 ° C до оптической плотности 0.6 до индукции 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Экспрессия белка продолжалась в течение 6 часов при 18 ° C, а затем клетки собирали из культур центрифугированием. Клетки лизировали ультразвуком, а затем центрифугировали второй раз для осветления лизата. Полученный супернатант очищали аффинной хроматографией с иммобилизованным металлом, используя TALON Metal Affinity Resin (Takara Bio USA, Mountain View, California). Все очищенные образцы белка хранили при 4 ° C со смесью ингибиторов протеазы пепстатина А и фенилметансульфонилфторида и использовали в течение недели.Анализ гелей SDS-PAGE перед использованием образцов показал отсутствие протеолиза.

Изотермическая титровальная калориметрия

Термодинамика связывания взаимодействия Panx и Ctp была получена при 25 ° C с помощью микрокалориметра VP-ITC (Microcal, Westborough, MA). Буфер для связывания состоял из 50 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ β-меркаптоэтанола, pH 7,5. Конструкции Panx помещали в реакционную ячейку в концентрации 10-20 мк М и титровали Ctp в концентрации 150-200 мк М.Данные для всех соответствовали простой модели связывания с одним сайтом в Origin 7.0, что позволило определить стехиометрию ( N ), константу диссоциации ( K d ) и изменение энтальпии ( ΔH ). , и энтропия ( ΔS ). Концентрации белка определяли путем измерения оптической плотности при 280 и 205 нм. Коэффициенты молярной экстинкции для каждой конструкции при 280 нм были рассчитаны с помощью инструмента ProtParam на веб-сайте ExPASy и являются следующими (Gasteiger E., 2005). Ctp = 17,420 M −1 см −1 , Panx, Panx TQT # 1 , Panx TQT # 2 = 15,930 M −1 см −1 . Точно так же коэффициенты молярной экстинкции для измерений при 205 нм были рассчитаны с помощью инструмента Protein Calculator (Anthis & Clore, 2013).

Подготовка библиотеки ChIP-seq

Протокол ChIP-seq был адаптирован из работы Шмидта и его коллег (Schmidt et al., 2009) и выполнен из OSC в соответствии с Фабри и коллегами (Fabry et al., 2019) с использованием коммерчески доступных кроличьих поликлональных анти-h4K9me3 (Active Motif, каталожный № 39161) и кроличьих поликлональных анти-h4K4me2 (Merck Millipore, каталожный № 07-030) антител. ChIP из клеток S2 выполняли с использованием того же протокола из 2 × 10 7 клеток с модификацией процедуры подготовки хроматина для обработки хроматина ультразвуком в течение 8 циклов по 30 секунд включения / 30 секунд с использованием Bioruptor Pico (Diagenode). Выделенная ДНК была количественно определена на системе Agilent TapeStation System с использованием высокочувствительной ленты для ДНК-скрининга (Agilent).Библиотеки секвенирования ДНК получали с помощью набора для подготовки библиотеки ДНК NEBNext Ultra II для Illumina (NEB; E7645) в соответствии с инструкциями производителя и количественно оценивали с помощью набора для количественной оценки библиотеки KAPA для Illumina (Kapa Biosystems). Библиотеки ChIP-seq клеток OSC и S2 секвенировали на Illumina HiSeq 4000 и NovaSeq 6000 соответственно.

Анализ ChIP-seq

Данные ChIP-seq от OSC секвенировали как односторонние 50bp с двумя повторами для каждого условия. Для нокдаунов nxf2, panx и piwi мы повторно проанализировали данные Фабри и его коллег (Fabry et al., 2019) с двумя повторами на условие. Адаптеры для секвенирования (Illumina TruSeq) и низкокачественные основы были удалены с помощью Trim Galore! (v0.6.4; с использованием cutadapt v1.18) с «—stringency 6 -q 20». Bowtie (v1.2.1.1) (Langmead et al., 2009) с «-S -n 2 -M 1 —best —strata —nomaqround —no-unal» использовался для выравнивания чтения как с эталонный геном ( dm6 ) и набор из 122 консенсусных последовательностей транспозонов. Дубликаты ПЦР были удалены из геномного выравнивания с использованием инструментов MarkDuplicates из Picard (v2.21.2).

Модуль bamCoverage от deepTools (v3.3.2) (Ramirez et al., 2016) с «—binSize 1 —ignoreForNormalization chrM —normalizeUsing CPM —extendReads 260 —centerReads —exactScaling —minMappingQuality 255» был используется для создания файлов BigWig для треков и графиков профиля UCSC Genome Browser, которые также смещают чтения к ожидаемой средней точке вставки. Матрицы данных для тепловых карт и графиков профилей вокруг вставок транспозонов были построены с использованием модуля computeMatrix в режиме «контрольной точки» с «—missingDataAsZero -b 10000 -a 15000 -referencePoint center» и с использованием размера ячейки 5 для профилей и 50 для тепловых карт. .Построение графиков было выполнено в R, и 95% доверительные интервалы среднего были рассчитаны с использованием начальной загрузки с 200 выборками начальной загрузки. Для удобства чтения значения тепловой карты были ограничены 99 процентилем . Графики покрытия консенсусных последовательностей транспозонов были созданы с использованием модуля genomecov от bedtools, подсчета всех считываний, отображаемых на каждый транспозон, с последующей нормализацией числа импульсов в минуту и ​​построением графиков с использованием R.

. перекрывающиеся бункеры, сохраняются только бункеры с отображаемостью> 50%.Были выявлены бункеры со следующими характеристиками; i) вблизи вставки (в пределах 1 т.п.н.) активированных транспозонов ( gypsy , mdg1 , blood, 297, 412 ), ii) вблизи вставки других транспозонов ( Juan, Bari1, 1360, pogo, Лопух , diver ) или iii) в области гетерохроматина на хромосоме 4 и на расстоянии более 10 т.п.н. от любой вставки. Для каждого нокдауна подсчитывались сопоставления считываний с каждым бункером, нормализовывались для сопоставимости и различий в размерах библиотек, и они усреднялись по двум повторам.Каждый нокдаун сравнивался с соответствующим контролем с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона.

Репортерный анализ в клетках S2 секвенировали как парные концы 2 × 50 пар оснований с двумя повторами на условие. Обрезка и выравнивание выполняли, как описано выше, за исключением того, что использовались Bowtie (v1.2.3) с дополнительными параметрами «-y —maxins 500 —fr —allow-contain», и это выравнивание проводилось против последовательности плазмиды, конкатенированной с геном dm6 . Дубликаты были удалены с помощью MarkDuplicates, а покрытие репортера при чтении было извлечено с помощью bamCoverage с помощью “—binSize 1 —ignoreForNormalization chrM —normalizeUsing CPM —extendReads —centerReads —exactScaling —outFileFormat bedgraph —region pBC470: 1: 6355 ».Список всех библиотек ChIP-seq, сгенерированных и проанализированных в этом исследовании, приведен в дополнительном файле № 4 .

Дорожки сопоставимости

Все треки сопоставимости были построены так, чтобы отражать длину считывания и стратегию выравнивания, используемую в каждом анализе. Короче говоря, мы использовали «bedtools makewindows -w n -s 1 — g genome.fa.fai> windows.bed», а затем «bedtools getfasta -fi genome.fa -bed windows.bed», чтобы построить все возможные n. -меры эталонного генома, где n — ожидаемая длина чтения.Для большинства библиотек n было равно 50. Для данных с парным концом 2 × 50bp мы аппроксимировали сопоставимость, используя как n = 100, так и построив все возможные пары по 50-мерам, разделенные средним расстоянием между парами чтения. Вторые сопряжения были созданы с использованием «сдвига постельных инструментов» с «-s 146» для перемещения координат с последующим извлечением обратной последовательности дополнения. Происходящие из генома n -меры или пары или n -меры были сопоставлены с эталонным геномом с помощью программного обеспечения и опций, используемых для сопоставления соответствующих данных секвенирования.Сопоставимость рассчитывалась как количество однозначно сопоставленных считываний, покрывающих координату, деленное на n . Для парных чтений 2 × 50 бит / с сопоставимость оценивалась как средняя сопоставимость из двух подходов, описанных выше.

Доступность данных

Данные о секвенировании, представленные в этой статье, депонированы в Gene Expression Omnibus (GSE160860). Данные масс-спектрометрии депонированы в архив PRIDE (PXD022103 и PXD022105).

Композитные подшипники | Запасные части Caterpillar®

, 416D, 420D, 424B, 424B HD, 424D, 426C, 428C, 430D, 436C
1K8041 926, 926A, 930, 930R, IT28
1545404 414E, 416C, 416D, 416E, 416F, 420D, 420E, 420F, 422E, 422F, 424D, 424D 428C, 428D, 428E, 428F, 430D, 430E, 430F, 432D, 432E, 432F, 434E, 434F, 436C, 438C, 438D, 442D, 442E, 444E, 444F, 450E, 450F
1832168
2G3686 120G
2775435 16M
3G0472 120H, NA 120H ES, 120K 120K , 120K 2, 120M, 135H, 135H NA, 943, 953, 953C, 953D, D4H, D4H XL, D5H, D5H XL, D5M, D5N
3G1076 963, 963B, 963C, 963D, 973D
3G1587 943, 953, 953C, 953D
3G2115 973, 973C, 973D
3G2579 120K, 120M, 12G, 12H, 12H ES, 12H NA, 12K, 12M, 130G, 140G, 140H, 140H ES, 140H NA, 140K, 140K 2, 140M, 143H, 160H, 160H ES, 160H NA, 160K, 160M, 163H, 163H NA, D6R, D6R STD, D6T, D6T LGP, D6T
3G2580 14G, 14H, 14H NA, 14M, 16G, 16H, 16H NA, 16M, 943, 953, 953C, 953D, D6R, D6R STD, D6T, D6T LGP , D6T
3G2581 120K, 120M, 120M 2, 12G, 12H, 12H ES, 12H NA, 12K, 12M, 12M 2, 12M 3, 12M 3 AWD, 130G, 140G, 140H, 140H ES, 140H NA, 140K, 140K 2, 140M, 140M 2, 140M 3, 140M 3 AWD, 143H, 160H, 160H ES, 160H
3G2582 14G, 14H, 14H NA, 14M, 16G, 16H, 16H NA, 16M, 24H, 24M
5V1713 920, 930, 930R, 950, 966C, 966R
6Y3548 D7H
7D8889 120H, 120H ES, 120H NA, 120K, 120K 2 , 120M, 120M 2, 12G, 12H, 12H ES, 12H NA, 12K, 12M, 12M 2, 12M 3, 12M 3 AWD, 130G, 135H, 135H NA, 140G, 140H, 140H ES, 140H NA, 140K, 140K 2, 140M, 140M 2, 140M 3
8D3309 16G, 16H, 16H NA, 16M
8D3311 16G, 16H, 16H NA, 16M
8D4137 14G, 14H , 14H NA, 14M
8D4138 14G, 14H, 14H NA, 14M
8D4496 120M, 14G, 14H, 14H NA, 14M
8D6629 12G, 130G, 140G, 160G
8D7083 12G, 130G, 140G, 14G
8D7084 14G
8D7086 120G, 120H, 120H ES, 120H NA, 120K, 120K 2, 120M, 120M 2, 12G, 12H, 12H ES, 12H NA, 12K, 12M, 12M 2, 12M 3, 12M 3 AWD, 130G, 135H, 135H NA, 140G, 140H, 140H ES, 140H NA, 140K, 140K 2, 140M, 140M 2
8D7282 12G, 130G
8D7284 120G, 12G, 130G
8D7685 120H, 120H ES, 120H NA, 120K, 120K 2, 120M, 135H, 135H NA, 14G, 14H, 14H NA, 14M, 16G
8D7996 120G, 120H, 120H ES, 120H NA, 120K, 120K 2, 120M, 120M 2 , 12G, 12H, 12H ES, 12H NA, 12K, 12M, 12M 2, 12M 3, 12M 3 AWD, 130G, 135H, 135H NA, 140G, 140H, 140H ES, 140H NA, 140K, 140K 2, 140M, 140M 2
8D8168 120H, 120H ES, 120H NA, 120K, 120K 2, 120M, 120M 2, 12G, 12H, 12H ES, 12H NA, 12K, 12M, 12M 2, 12M 3, 12M 3 AWD, 130G, 135H, 135H NA, 140G, 140H, 140H ES, 140H NA, 140K, 140K 2, 140M, 140M 2, 140M 3
8D8572 120G, 12G, 130G, 140G, 160G, 16G, 16H, 16H NA, 16M, FB221
8D8704 16G, 16H, 16H NA, 16M
8D8888 16G, 16H, 16H NA, 16M
8D9159 12H, 12H ES, 12H NA , 12K, 12M, 12M 2, 12M 3, 12M 3 AWD, 140H, 140H ES, 140H NA, 140K, 140K 2, 140M, 140M 2, 140M 3, 140M 3 AWD, 143H, 14G, 14H, 14H NA, 14 M, 160H, 160H ES, 160H NA, 160K, 160M, 160M 2
8D9296 120G, 120H, 120H ES, 120H NA, 120K, 120K 2, 120M, 135H, 135H NA
8D9507 16G, 16H, 16H NA, 16M
8D9652 14G, 14H, 14H NA, 14M
8D9814 120G, 120H, 120H ES, 120H NA, 120K, 120K 2, 135H, 135H NA , 784C, 785C, 785D, 789C, 789D, 793C, 793D, 793F, 793F AC, 793F CMD, 793F OEM, 793F-XQ, 795F AC, 795F XQ, 797, 797B, 797F, 844K, 854K, 990K
8X5021 120H, 120H ES, 120H NA, 120K, 120K 2, 120M, 120M 2, 12M, 135H, 135H NA, 14M
8X5108 12H, 12H ES, 12H NA, 12K, 12M, 12M 2, 12M 3, 12M 3 AWD, 140H, 140H ES, 140H NA, 140K, 140K 2, 140M, 140M 2, 140M 3, 140M 3 AWD, 143H, 160H, 160H ES, 160H NA, 160K, 160M, 160M 2 , 160M 3
9D0047 120G, VFS70
9D0057 120G
9D0178 120G, 120H, 120H ES, 120H NA, 120K, 120K 2, 120M, 120M 2, 12M, 135H, 135H NA
9D1511 120G
9D1512 120G
9h4278 814, 815, 816, 950, 955H, 966C, 966R, 977H, 980B, 988
9R7215 422E, 424D, 428B, 428C, 428D, 428E, 434D, 432 , 438, 438B, 438C, 438D, 442D, 442E, 444E

Коэффициенты tsa CTP.Коэффициент tšimong ea ОСАГО. CTP ke sebakeng коэффициент

Ка ла 1 апреля 2015 года лебатова автогражданки коэффициенты не хлахисва Россия, ‘ме ка мор’а либеке це линг це пели — фетоцэн ботлаасенг. Ditefello di eketsehile ka 40%. Kamoo bakhanni ba bangata hona joale ba na ho lefa bakeng sa leano la MTPL?

liphetoho molao

Девальвация валюты, ba ntse ba eketseha ka ditefello tse tekanyong e ho fokotsa unprofitable autocitizen karolo ea inshorense maraka — lintlha tsena tsohle lebisa eketseha ho eketsoatsea ka ditea 2015.

Коэффициент tsimong ea CTP eketsehileng libakeng tse 11 tsa Russia le ‘ngoe bakeng sa palo e tšoanang fokotsehile. ditefello lebetsoeng le kgolo ya 25% ho fanweng libaka Чувашия, Воронеж, Курган. Ка Магаданский дитефелло себакенг тла фокола ка 41%. Ка Дагестан, Лена, Ингушетия, Чечня ле Ленинград себакенг ке себакенг коэффициент ОСАГО фокоцеха.

Дипалело нэ МГУ лицеби. Ho latela boitsebiso bo fumaneng, libakeng tse ling ho ne ho hlokahala hore ho eketsa ba tsoella ka setjhaba mekhoa lipalangoang tse fetang 400%.Phetoho ea sebele ee необходимо на 100%. Lekaneng ditefiso keketseho ea ‘maraka ho ne ho letile ka lilemo tse’ maloa. PCA lumela hore hona joale ho tla etsa hore ho ntlafatsa boleng ba sireletsa le ho tsitsa mesebetsi e amanang le.

Ho phaella moo, tsamaisong e ncha ea ho fumana tefo e potlakileng bakeng sa ha e le hantle ya ho senya bophelo le bophelo bo botle ba lehlatsipa. Nakong e fetileng, ditefello tse tsohle entsoeng ka mora kalafo ea, motheong oa romelwa квитанции. Тефо Хона Джоале Ка Фумана Се Чувство Матленг Я Лехлаципа, Эмпа Хапе Ба Хе Бен Хауфи-Уфи.

ditheko

licsenyehelo tsa ho ba leano la ho se entsoe ka nagla le ditefello khethehileng. Коэффициенты tsa molao CTP behiloeng ke mmuso. лихамфани иншоренсе ке ке уа фетола ба у итхата. Qetellong ea 2014 ea Regator e eketsehile boholo palo e kahodimodimo ea ditefello tse avtograzhdanki ho li-ruble 400 sekete, ‘me hore lik’hamphani tse sa lahleheloa ke chelete — .. Eketseha ditefisa kelano tsa lona 50%

Mokhoa oa ho lekanya litšenyehelo

moralo e bonolo haholo: коэффициенты ОСАГО без оплаты ли экетсеха ка секхала хо лефиса.Empa makgabane bobeli itshetlehile lintlha tse ‘maloa: .. Resume mokhanni ea sebaka se lula koloi, boemo koloi, joalo-joalo The moralo tloaelehileng bakeng sa manolotsoeng e tjena:

Leano RT = TDB x, x, x, BM FAC OK x, x, x, C: x КМ кн доступность: x n g, moo:

  • BT — sekhahla botlaaseng.
  • CT — коэффициент ОСАГО paballo ya naha.
  • KBC — e pontshi ea lilemo / bolelele tsa tšebeletso.
  • BM — bonase-malus.
  • ОК — фокотса теканьо.
  • км — матла.
  • C — сезонность.
  • KH — коэффициент мафу.
  • P — e pontshi nako inshorense ya.

Theko e phahameng ka ho fetisisa inshorense e tla chelete ea bacha ba tsoela pele likoloi matla metseng e meholo. Ditjeo bakhanni nang le phihlelo le kotsi ntle boiphihlelo ho khanna ka lilemo tse fetang 10 e tla fokolang haholo.

Sekhahla mantlha

MTPL theko leano fapana ke sebaka. Bakeng sa e mong le e mofuta oa ho tsamaisa, ho itšetlehile ka palo ea litulo le tonnage ,be ditefiso tsa lona.Bakeng sa beng ba likoloi e arotsoe, ho ea ka boemo bo phahameng ba bona ba pre-kapa mekhatlo ea molao. O e-s’o fetohe ho tloha 2004. Bakeng sa dikontraka tse kena ka mora oa 1 апреля 2015, ho tla sebelisoa коэффициенты joalo oa inshorense ditefiso CTP:

Lithuthuthu le Scooters — 1507 лир.

Автомобилей:

  • батхо ба семолао — 2945 ли-рубль ;.
  • батхо ка бомонг, ИП — 2455 ли-рублей.

Mechine e sebelisoa e le tekesi ka, — 3677 лир.

литерака:

  • ле пало е каходимодимо люмелецкое бойма ба литане це 16 — 2511 ли-руб .;
  • boima ba lithane tse fetang 16 — 4018 ли-руб.

Библиотека:

  • ле 20 литуло мопалами — 2009 ли-рубль .;
  • я дитуло 21 капа хо фета — 2511 ли-руб .;
  • Текеси — 3677 лир.

Ка мотлакасе — лирль 2009 г.

Трамвай — 1252 лир.

Литерекере — 1507 лир.

litsupa ea sebaka

Ntho e ‘Sena se ka haholo ama dipalelo ena. Ho itšetlehile ka sebaka sa tshebetso sa tshebetso sa mathomo koloi. Ha konteraka e entsoeng ka motho a le mong, ka nako eo oile a sebelisa sebaka sa likoloi ngolisitsoeng, ‘me bakeng sa bagwebi — sebaka sa boemo ngodiso ya mokhatlo o hlophisitsoeng.

Холо ка хо фетисиса себакенг сео каро-каролелано ОСАГО и себедисва либакэнг цэ моце-мохоло ле и себетэфэ котси ле пахаменг махлоризо (Казань, Пермь, Якутск, Хабаровск).Bakeng sa likoloi tse matla ekelletsa moo balwa phahameng. Ka lebaka leo, TC bakgweetsi molmo ngodisa SUV kapa teraka ka e phelang e lekanyelitsoeng sebakeng seo. Новая ОСАГО выплачена в 2015 году в тафоле и карабине. Bakeng sa literekeng tse 11 le litsupa di eketseha, ‘me bakeng sa ho ba bang ba — ba fokotsehile. Ka Moscow boleng ba li-index e lutse e sa fetohe.

себакенг

ОСАГО — коэффициенты нтжха

Ленинград себакенг, Камчатка себакенг,
Адыгея

1.3

Республика Тыва, Чеченская Республика,
Район Бажуда икемеценг ка, Байконур

цэ 0,6

Забайкальский край, хоз Область Магадан,
Дагестан

0,6-0,7

Ингушетия

0,6-0,8

Rephabliking ea Sakha

0,6-1.2

себакенг Мурманск

1,2–2,1

Мордовия

0,8–1,5

себакенг Амур

1-1,6

себакенг Воронеж

0,5–1,1

себакенг Ульяновск

0,9–1,5

Чувашия

0.8-1,7

Себакенг Курган

0,6–1,4

себакенг Хабаровск

1-2,1

Ремонт в Марий Эл

0,7-1

Bonus-malus

Ho seng joalo, parameter ena o bitsoa theolelo bakeng sa bothata-mahala palama. Э ка хахоло ама теко еа леано ла. коэффициент ena e abeloa e thehiloeng ya data ka ho ba teng / sieo ha itseng payout mokhanni sebakeng sa koloi.E le hore le Phetolo ya koloi kapa inshorense khampani ho fetola tekanyo ha e ame. sehlopha sa e ntlafalitsoeng qetellong ea selemo ho tloha letatsing la qetello ea konteraka ya. Коэффициенты CTP ba balwa ho latela maano a fetileng, e karohano pakeng tsa konteraka e ne e se dikgwedi tse fetang 12. Ho seng joalo, ka abeloa koloi mong’a boraro botlaaseng sehlopha sa.

makolopetso

Haeba ka nako e kenella mokhanni e ne e le boikarabelo ba ho hlaheloa ke kotsi, ho tla sebetsa CTP eketsehileng ditefello.Leano e ncha e tla chelete 50% theko e phahameng ho feta. Bakeng sa ntle selemo, moreki and fumana le monyaolo oa 5%. Ha leano la ho e ntša ka lekhetlo la pele, boleng ba li-index ke 1. Theolelo lebetsoeng le e 50%. Ha leano la ho se ngotsoe bakhanni ‘maloa (ka mohlala, ntate oa ka lipampiri ka mora oa hae),’ me e mong oa bona a sa tsoa o ile a fumana litaba tsa molao, joale e ntan’o ba li-index e балва ка теканьо боняне. Kahoo, ho fetola boleng ba leano ОСАГО.

Новые коэффициенты BM fumana mokhanni sehlopha sa.Ka mohlala, haeba motho o ne a ka sehlopheng 5-й индекс le boleng, равный 0,9, ‘me ntan’o ba ho ba molato oa hae oa ho hlaheloa ke kotsi, joale selemong se latelang ho theolelo tla tepella ho 5%, le lintlha — ho fihlela ho 3. Ha latelang likhoeli 12 tla mathateng ntle, e mokhanni o lebeletse hore boemo ba ka e phahameng 6.

ho fumana boitsebiso bo

Bonus-malus Ho thehoa ka lebaka la historyi ea ditlaleo inshorense. Ho boloka tlaleho ea bona, e khethehileng setsi PCA ileng ba bōptjoa ka 2013.E mong le e страховщик hara matsatsi a 15 ka mor’a ho saena molaoli ea fetisetsa ya data.

Возраст / boiphihlelo

Phihlelo feta bokeletseng mokhanni, e ka tlaase boleng ba pontshi ena. Empa ho na le litšoantšo tse peli tsa bohlokoa: ho lilemo tse khanna (lilemo tse 22) ‘me likhoeli tse 36 of khanna. Tabeng ena, Bude phahameng ka ho fetisisa li-index boleng — 1,8. Ha bakhanni ba ‘maloa, e elwa hloko boleng palo e kahodimodimo ea li-index ya.

Fokotsa lintlha tsa CTP (2014)

The inshorense ka kena bakhanni ngata.Ha leano la ho ba tla ho tse thathamisitsoeng ka lebitso, ha ho tsotellehe palo (2 капа 5). Ntho e ke ke ea fetoha. Empa haeba mokhanni a hlile ke ke bolella ba tla nne sebelisa koloi, empa lumela ya monyetla joalo, ho sebelisa boleng ba 1,8.

сезонность

bakhanni ba bangata ba sebelisa koloi feela nakong ea lehlabula ‘me mariha li siuoa ka karache le. Kapa sebetsa koloi nakong maeto e telele. Maemong a joalo, ho ile a ntša leano ka linako tse itseng bakeng sa ho nako efe kapa efe ya dikgwedi 3.Index boleng o lekana le e mong, ho qala ka likhoeli tse 10 tsa tshebetso. Le e ‘ngoe e khutsoanyane ka itšetleha ka le monyaolo hanyenyane.

ditlolo коэффициент

E e sebelisoa ka Maemong a joalo:

  • ho etsa lipolelo tse bohata;
  • ханна ха тахилоэ;
  • boomo qholotsoa tsa hlaheloa ke kotsi;
  • tsamaea sebakeng seo;
  • хо фумана мото еа ка мор’а лебили и са нгоцое ка леано ла хо.

Litsupa ya inshorense bophelo le matla a dilenaneo

Origin fapana pakeng tsa 0,2 ho ea ho 1 le e sebediswa feela tsoang linaheng tse ling kapa ha koloi e tsamaea ka kangoo.Двигатель матла ка боноа ПТСД. karo-karolelano ena e balwa ka mosebetsi wa лошадиные силы. Ha litokomane tsa ho boletsweng kowatts, tšokoloho e tjena: 1 KW = 1.359 dilitara tse. е.

Cars k’haravene

Bakeng sa koloi e le ‘ngoe e se e ditefiso e sa faneng. Empa ntshetswa pele ka коэффициент khethehileng, e leng itšetlehile ka mofuta oa прицеп, ho tloha 1,15 ho 1,45.

Le lakane e hloekileng

Histori ea inshorense e apare motho ea nang le litokelo le laola koloi.Empa ya data a hleka, haeba ka hare ho likhoeli tse 12 ba mokhanni ha e kena CTP efe kapa efe leano. Mohlala: хо на монг’а колои ка копа монг’а ликолои ле хоэца qeto ea konteraka ntle batho ba o ile a lumela ho ya taolo. Ka mor’a likhoeli tse 12 ца историй ea eona ke ho seta botjha, ho tla ba bonolo ho tekena leano bona. Koloi beng ba lokela ho qala ka nchafatsa litokomane ho mong ka eena, ‘me joale le tsoele pele ho e le matla a’ muelli oa molao.

liphetoho tse ling

monyetla oa ho etsa qeto ea konteraka ya nako e ka tlaase ho selemo e mong hona joale li fumaneha.Joalo hlokahale a ka ‘na a hlaha, ka mohlala, haeba koloi e fumaneng sebakeng se le seng,’ me mokhanni o batla ho ngodisa e ka tse ling. Nakong e fetileng, bakeng sa merro e joalo, leano la ho ile ka reka bakeng sa matsatsi a ‘maloa. Joale inshorense joalo ka o ile a ntša feela ho likoloi tsoang linaheng tse ling. Kahoo Bahlabani ка чувствует это qeto ea konteraka ka linako tse itseng. Bakeng sa nang le koloi ka thepa LPG fanoe 15% theolelo.

Litšenyehelo le setsi sa maano a metseng e meholo ea Russia

Ka mohlala, nka palo e kahodimodimo ya data ditefello bakhanni lilemo tse 23 le phihlelo ea taolo ya le koloi khalemo tsea nileang en feat. 70-100 к.е.

торопо

теко Хале (руб.)

theko Новый (руб.)

Хабаровск

3964

6342

Хабаровск

4814

7701

Иркутск

4814

7701

Красноярск

5097

8154

Новосибирск

4814

7701

Екатеринбург

5097

8154

Хабаровск

5663

9513

Москва

5663

9060

Краснодар

5097

8154

bofello

Ka April 2015 le Banka ea Russia fetohile karo-karolelano ea CTP ke sebaka se le ditefello tsa motheo.Dipopontshwa tla lula ho eketseha palo palo e kahodimodimo ea ditefello tse le le mathata a moruo ka har’a naha. Ка какаретсо, le ditefello kgolo ya ea e-ba 40-60%. Коэффициенты tsa taolo ea sebaka fetohile feela libakeng tse 11. ditefello botlaaseng ba boetse ba eketseha ha libakeng tsohle. Ho na le ke коэффициент e ncha bakeng sa likoloi le k’haravene e. Це-ка-заяц проходит в зависимости от сезона.

Проверка лиганда: 5A2X

Навигационные вкладки

CTP: CYTIDINE-5′-TRIPHOSPHATE

Определение лиганда и краткое изложение CTP

CTP является лигандом, представляющим интерес в 5A2X3

Наиболее подходящий экземпляр в этой записи Другие экземпляры в этой записи
Наиболее подходящий экземпляр в этой записи
Наиболее подходящие экземпляры PDB (верхние 5)
Идентификатор Рейтинг соответствия Рейтинг геометрии Фактор R в реальном пространстве Коэффициент корреляции в реальном пространстве RMSZ-длина связи RMSZ-угол соединения Выбросы длины связи Выбросы связного угла Атомные конфликты Стереохимические ошибки Модель завершена eness Средняя загрузка
5A2X_CTP_A_1528 22% 45% 0.244 0,855 0,68 1,46 — 3 0 0 100% 1
5A2X_CTP_B_1529 16% 45% 0,829 0,66 1,49 — 4 0 0 100% 1
6Q2P_CTP_B_404 100% 38% 0.05 0,991 1,4 1,12 5 3 0 0 100% 1
5EWE_CTP_A_501 99% 47% 0,056 0,988 0,8 1,28 — 3 0 0 100% 1
5BO7_CTP_A_410 98% 36% 0.06 0,985 1,25 1,4 2 3 0 0 100% 1
2XWL_CTP_A_301 98% 47% 0,056 0,978 0,74 1,3 1 3 1 0 100% 1
5TKV_CTP_B_601 98% 43% 0.078 0,996 0,78 1,49 — 5 1 0 100% 1

% PDF-1.3 % 141 0 объект> эндобдж xref 141 704 0000000016 00000 н. 0000015797 00000 п. 0000015881 00000 п. 0000016071 00000 п. 0000024155 00000 п. 0000024946 00000 п. 0000025151 00000 п. 0000025216 00000 п. 0000025264 00000 п. 0000025311 00000 п. 0000025358 00000 п. 0000025405 00000 п. 0000025452 00000 п. 0000025499 00000 п. 0000025546 00000 п. 0000025593 00000 п. 0000025640 00000 п. 0000025687 00000 п. 0000025734 00000 п. 0000025781 00000 п. 0000025828 00000 п. 0000025875 00000 п. 0000025922 00000 п. 0000025969 00000 п. 0000026016 00000 п. 0000026063 00000 п. 0000026110 00000 п. 0000026157 00000 п. 0000026204 00000 п. 0000026251 00000 п. 0000026298 00000 н. 0000026345 00000 п. 0000026392 00000 п. 0000026439 00000 п. 0000026486 00000 п. 0000026533 00000 п. 0000026580 00000 п. 0000026627 00000 н. 0000026674 00000 п. 0000026721 00000 п. 0000026768 00000 н. 0000026815 00000 п. 0000026863 00000 п. 0000026910 00000 п. 0000026957 00000 п. 0000027004 00000 п. 0000027051 00000 п. 0000027098 00000 п. 0000027145 00000 п. 0000027192 00000 н. 0000027239 00000 н. 0000027286 00000 п. 0000027333 00000 п. 0000027380 00000 п. 0000027427 00000 н. 0000027474 00000 п. 0000027521 00000 п. 0000027568 00000 п. 0000027615 00000 н. 0000027663 00000 п. 0000027710 00000 п. 0000027758 00000 п. 0000027805 00000 п. 0000027852 00000 н. 0000027899 00000 н. 0000027946 00000 н. 0000027993 00000 н. 0000028040 00000 п. 0000028087 00000 п. 0000028134 00000 п. 0000028181 00000 п. 0000028228 00000 п. 0000028275 00000 п. 0000028322 00000 п. 0000028369 00000 п. 0000028416 00000 п. 0000028463 00000 п. 0000028510 00000 п. 0000028557 00000 п. 0000028604 00000 п. 0000028651 00000 п. 0000028698 00000 п. 0000028745 00000 п. 0000028792 00000 п. 0000028839 00000 п. 0000028886 00000 п. 0000028933 00000 п. 0000028980 00000 п. 0000029027 00000 н. 0000029074 00000 н. 0000029121 00000 п. 0000029168 00000 п. 0000029215 00000 п. 0000029262 00000 п. 0000029309 00000 п. 0000029356 00000 п. 0000029403 00000 п. 0000029450 00000 п. 0000029497 00000 п. 0000029544 00000 п. 0000029591 00000 п. 0000029638 00000 п. 0000029685 00000 п. 0000029732 00000 п. 0000029779 00000 п. 0000029826 00000 п. 0000029873 00000 п. 0000029920 00000 н. 0000030895 00000 п. 0000031567 00000 п. 0000032239 00000 п. 0000033077 00000 п. 0000033812 00000 п. 0000034370 00000 п. 0000034832 00000 п. 0000035330 00000 п. 0000035541 00000 п. 0000035764 00000 п. 0000036507 00000 п. 0000037895 00000 п. 0000069509 00000 п. 0000116712 00000 н. 0000140954 00000 н. 0000141143 00000 н. 0000141368 00000 н. 0000141455 00000 н. 0000141636 00000 н. 0000141720 00000 н. 0000141899 00000 н. 0000142074 00000 н. 0000142134 00000 н. 0000142302 00000 н. 0000142482 00000 н. 0000142685 00000 н. 0000142748 00000 н. 0000142917 00000 н. 0000142983 00000 н. 0000143153 00000 н. 0000143333 00000 н. 0000143510 00000 н. 0000143688 00000 н. 0000143872 00000 н. 0000143932 00000 н. 0000144101 00000 п. 0000144167 00000 н. 0000144337 00000 н. 0000144514 00000 н. 0000144689 00000 н. 0000144752 00000 н. 0000144921 00000 н. 0000145101 00000 п. 0000145278 00000 н. 0000145462 00000 н. 0000145528 00000 н. 0000145698 00000 п. 0000145879 00000 н. 0000146057 00000 н. 0000146241 00000 н. 0000146304 00000 н. 0000146473 00000 н. 0000146660 00000 н. 0000146837 00000 н. 0000147018 00000 н. 0000147196 00000 н. 0000147380 00000 н. 0000147443 00000 н. 0000147612 00000 н. 0000147796 00000 н. 0000147973 00000 п. 0000148157 00000 н. 0000148332 00000 н. 0000148392 00000 н. 0000148560 00000 н. 0000148740 00000 н. 0000148918 00000 н. 0000149105 00000 н. 0000149296 00000 н. 0000149473 00000 н. 0000149664 00000 н. 0000149724 00000 н. 0000149892 00000 н. 0000150079 00000 н. 0000150256 00000 н. 0000150453 00000 п. 0000150631 00000 н. 0000150815 00000 н. 0000150878 00000 н. 0000151047 00000 н. 0000151258 00000 н. 0000151439 00000 н. 0000151648 00000 н. 0000151823 00000 н. 0000152040 00000 н. 0000152103 00000 н. 0000152272 00000 н. 0000152453 00000 н. 0000152631 00000 н. 0000152694 00000 н. 0000152863 00000 н. 0000153068 00000 н. 0000153240 00000 н. 0000153300 00000 н. 0000153468 00000 н. 0000153645 00000 н. 0000153826 00000 н. 0000154001 00000 н. 0000154182 00000 н. 0000154242 00000 н. 0000154410 00000 н. 0000154476 00000 н. 0000154646 00000 н. 0000154827 00000 н. 0000155008 00000 н. 0000155183 00000 н. 0000155364 00000 н. 0000155427 00000 н. 0000155596 00000 н. 0000155656 00000 н. 0000155824 00000 н. 0000156001 00000 н. 0000156182 00000 н. 0000156360 00000 н. 0000156544 00000 н. 0000156610 00000 н. 0000156780 00000 н. 0000156843 00000 н. 0000157012 00000 н. 0000157189 00000 н. 0000157373 00000 н. 0000157548 00000 н. 0000157729 00000 н. 0000157789 00000 н. 0000157957 00000 н. 0000158020 00000 н. 0000158189 00000 н. 0000158370 00000 н. 0000158554 00000 н. 0000158732 00000 н. 0000158916 00000 н. 0000158979 00000 н. 0000159148 00000 н. 0000159214 00000 н. 0000159384 00000 н. 0000159565 00000 н. 0000159746 00000 н. 0000159927 00000 н. 0000160108 00000 н. 0000160174 00000 п. 0000160344 00000 п. 0000160404 00000 н. 0000160572 00000 н. 0000160753 00000 н. 0000160937 00000 н. 0000161118 00000 н. 0000161289 00000 н. 0000161460 00000 н. 0000161634 00000 н. 0000161808 00000 н. 0000162025 00000 н. 0000162203 00000 н. 0000162377 00000 н. 0000162590 00000 н. 0000162768 00000 н. 0000162949 00000 н. 0000163015 00000 н. 0000163185 00000 н. 0000163369 00000 н. 0000163553 00000 н. 0000163616 00000 н. 0000163785 00000 н. 0000163966 00000 н. 0000164147 00000 н. 0000164207 00000 н. 0000164375 00000 н. 0000164559 00000 н. 0000164743 00000 н. 0000164809 00000 н. 0000164979 00000 н. 0000165159 00000 н. 0000165341 00000 п. 0000165407 00000 н. 0000165577 00000 н. 0000165757 00000 н. 0000165937 00000 н. 0000166000 00000 н. 0000166169 00000 н. 0000166353 00000 п. 0000166537 00000 н. 0000166597 00000 н. 0000166765 00000 н. 0000166945 00000 н. 0000167125 00000 н. 0000167188 00000 н. 0000167357 00000 н. 0000167541 00000 н. 0000167721 00000 н. 0000167899 00000 н. 0000167962 00000 н. 0000168131 00000 н. 0000168215 00000 н. 0000168391 00000 н. 0000168571 00000 н. 0000168754 00000 н. 0000168938 00000 н. 0000169121 00000 н. 0000169184 00000 н. 0000169353 00000 н. 0000169431 00000 н. 0000169605 00000 н. 0000169785 00000 н. 0000169964 00000 н. 0000170143 00000 п. 0000170221 00000 н. 0000170395 00000 н. 0000170574 00000 н. 0000170757 00000 н. 0000170937 00000 н. 0000171000 00000 н. 0000171169 00000 н. 0000171353 00000 н. 0000171537 00000 н. 0000171603 00000 н. 0000171773 00000 н. 0000171842 00000 н. 0000172013 00000 н. 0000172197 00000 н. 0000172380 00000 н. 0000172559 00000 н. 0000172742 00000 н. 0000172808 00000 н. 0000172978 00000 н. 0000173050 00000 н. 0000173222 00000 н. 0000173405 00000 н. 0000173584 00000 н. 0000173767 00000 н. 0000173946 00000 н. 0000174009 00000 н. 0000174178 00000 н. 0000174361 00000 н. 0000174544 00000 н. 0000174613 00000 н. 0000174784 00000 н. 0000174853 00000 н. 0000175024 00000 н. 0000175203 00000 н. 0000175386 00000 н. 0000175455 00000 н. 0000175626 00000 н. 0000175809 00000 н. 0000175992 00000 н. 0000176171 00000 н. 0000176350 00000 н. 0000176419 00000 н. 0000176590 00000 н. 0000176656 00000 н. 0000176826 00000 н. 0000177009 00000 н. 0000177188 00000 н. 0000177371 00000 н. 0000177550 00000 н. 0000177619 00000 н. 0000177790 00000 н. 0000177859 00000 н. 0000178030 00000 н. 0000178214 00000 н. 0000178398 00000 н. 0000178464 00000 н. 0000178634 00000 н. 0000178814 00000 н. 0000178993 00000 н. 0000179172 00000 н. 0000179244 00000 н. 0000179416 00000 н. 0000179599 00000 н. 0000179782 00000 н. 0000179857 00000 н. 0000180030 00000 н. 0000180210 00000 н. 0000180389 00000 н. 0000180455 00000 н. 0000180625 00000 н. 0000180808 00000 н. 0000180988 00000 н. 0000181063 00000 н. 0000181236 00000 н. 0000181418 00000 н. 0000181596 00000 н. 0000181662 00000 н. 0000181832 00000 н. 0000182016 00000 н. 0000182200 00000 н. 0000182266 00000 н. 0000182436 00000 н. 0000182616 00000 н. 0000182796 00000 н. 0000182987 00000 н. 0000183165 00000 н. 0000183342 00000 п. 0000183426 00000 н. 0000183602 00000 н. 0000183793 00000 н. 0000183971 00000 н. 0000184162 00000 н. 0000184340 00000 н. 0000184524 00000 н. 0000184734 00000 н. 0000184911 00000 н. 0000185085 00000 н. 0000185272 00000 н. 0000185338 00000 п. 0000185508 00000 н. 0000185682 00000 н. 0000185866 00000 н. 0000186050 00000 н. 0000186280 00000 н. 0000186464 00000 н. 0000186648 00000 н. 0000186822 00000 н. 0000187003 00000 н. 0000187069 00000 н. 0000187239 00000 н. 0000187410 00000 н. 0000187594 00000 н. 0000187778 00000 н. 0000187844 00000 н. 0000188014 00000 н. 0000188194 00000 н. 0000188374 00000 н. 0000188440 00000 н. 0000188610 00000 н. 0000188794 00000 н. 0000188965 00000 н. 0000189031 00000 н. 0000189201 00000 н. 0000189372 00000 н. 0000189553 00000 п. 0000189737 00000 н. 0000189924 00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001

00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001

00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 00001 00000 н. 0000192286 00000 н. 0000192352 00000 н. 0000192522 00000 н. 0000192736 00000 н. 0000192920 00000 н. 0000193104 00000 н. 0000193316 00000 н. 0000193496 00000 н. 0000193559 00000 н. 0000193728 00000 н. 0000193909 00000 н. 0000194090 00000 н. 0000194153 00000 н. 0000194322 00000 н. 0000194506 00000 н. 0000194587 00000 н. 0000194766 00000 н. 0000194943 00000 н. 0000195146 00000 н. 0000195323 00000 н. 0000195510 00000 н. 0000195694 00000 н. 0000195886 00000 н. 0000196070 00000 н. 0000196296 00000 н. 0000196362 00000 н. 0000196532 00000 н. 0000196607 00000 н. 0000196784 00000 н. 0000196968 00000 н. 0000197155 00000 н. 0000197336 00000 н. 0000197399 00000 н. 0000197568 00000 н. 0000197749 00000 н. 0000197932 00000 н. 0000197995 00000 н. 0000198164 00000 н. 0000198348 00000 н. 0000198532 00000 н. 0000198719 00000 н. 0000198899 00000 н. 0000199083 00000 н. 0000199261 00000 н. 0000199434 00000 н. 0000199602 00000 н. 0000199803 00000 н. 0000199869 00000 н. 0000200039 00000 п. 0000200219 00000 п. 0000200400 00000 н. 0000200584 00000 н. 0000200765 00000 н. 0000200945 00000 н. 0000201005 00000 н. 0000201173 00000 н. 0000201354 00000 н. 0000201538 00000 н. 0000201604 00000 н. 0000201774 00000 н. 0000201955 00000 н. 0000202136 00000 н. 0000202196 00000 н. 0000202364 00000 н. 0000202548 00000 н. 0000202732 00000 н. 0000202916 00000 н. 0000203096 00000 н. 0000203276 00000 н. 0000203453 00000 н. 0000203637 00000 н. 0000203818 00000 н. 0000203998 00000 н. 0000204179 00000 н. 0000204359 00000 н. 0000204425 00000 н. 0000204595 00000 н. 0000204775 00000 н. 0000204956 00000 н. 0000205137 00000 н. 0000205197 00000 н. 0000205365 00000 н. 0000205549 00000 н. 0000205730 00000 н. 0000205793 00000 н. 0000205962 00000 н. 0000206143 00000 н. 0000206323 00000 н. 0000206503 00000 н. 0000206683 00000 н. 0000206860 00000 н. 0000207044 00000 н. 0000207228 00000 н. 0000207408 00000 н. 0000207588 00000 н. 0000207765 00000 н. 0000207945 00000 н. 0000208125 00000 н. 0000208305 00000 н. 0000208485 00000 н. 0000208665 00000 н. 0000208859 00000 н. 0000209036 00000 н. 0000209213 00000 н. 0000209397 00000 н. 0000209574 00000 н. 0000209751 00000 н. 0000209935 00000 н. 0000210112 00000 н. 0000210292 00000 н. 0000210469 00000 п. 0000210649 00000 п. 0000210826 00000 н. 0000211010 00000 н. 0000211190 00000 п. 0000211367 00000 н. 0000211544 00000 н. 0000211728 00000 н. 0000211912 00000 н. 0000212102 00000 н. 0000212282 00000 н. 0000212462 00000 н. 0000212639 00000 н. 0000212819 00000 н. 0000212996 00000 н. 0000213173 00000 п. 0000213357 00000 н. 0000213420 00000 н. 0000213589 00000 н. 0000213769 00000 н. 0000213949 00000 н. 0000214126 00000 н. 0000214306 00000 н. 0000214483 00000 н. 0000214658 00000 н. 0000214838 00000 н. 0000215015 00000 н. 0000215075 00000 н. 0000215243 00000 н. 0000215423 00000 н. 0000215600 00000 н. 0000215781 00000 н. 0000215958 00000 н. 0000216138 00000 н. 0000216316 00000 н. 0000216493 00000 н. 0000216559 00000 н. 0000216729 00000 н. 0000216910 00000 н. 0000217085 00000 н. 0000217262 00000 н. 0000217442 00000 н. 0000217619 00000 н. 0000217799 00000 н. 0000217976 00000 н. 0000218153 00000 п. 0000218330 00000 н. 0000218393 00000 н. 0000218562 00000 н. 0000218742 00000 н. 0000218922 00000 н. 0000219099 00000 н. 0000219279 00000 н. 0000219463 00000 н. 0000219641 00000 п. 0000219821 00000 н. 0000219998 00000 н. 0000220058 00000 н. 0000220226 00000 н. 0000220406 00000 н. 0000220586 00000 н. 0000220767 00000 н. 0000220959 00000 н. 0000221139 00000 н. 0000221317 00000 н. 0000221497 00000 н. 0000221677 00000 н. 0000221740 00000 н. 0000221909 00000 н. 0000222089 00000 н. 0000222266 00000 н. 0000222441 00000 н. 0000222507 00000 н. 0000222677 00000 н. 0000222854 00000 н. 0000223038 00000 н. 0000223218 00000 н. 0000223398 00000 н. 0000223575 00000 н. 0000223755 00000 н. 0000223933 00000 н. 0000224110 00000 н. 0000224173 00000 н. 0000224342 00000 н. 0000224522 00000 н. 0000224699 00000 н. 0000224876 00000 н. 0000225051 00000 н. 0000225228 00000 н. 0000225288 00000 н. 0000225456 00000 н. 0000225636 00000 н. 0000225816 00000 н. 0000225994 00000 н. 0000226054 00000 н. 0000226222 00000 н. 0000226402 00000 н. 0000226582 00000 н. 0000226762 00000 н. 0000226946 00000 н. 0000227126 00000 н. 0000227301 00000 н. 0000227485 00000 н. 0000227548 00000 н. 0000227717 00000 н. 0000227901 00000 н. 0000228078 00000 н. 0000228258 00000 н. 0000228436 00000 н. 0000228623 00000 н. 0000228686 00000 н. 0000228855 00000 н. 0000229035 00000 н. 0000229215 00000 н. 0000229402 00000 н. 0000229580 00000 н. 0000229643 00000 н. 0000229812 00000 н. 0000229989 00000 н. 0000230164 00000 п. 0000230351 00000 п. 0000230538 00000 п. 0000230718 00000 н. 0000230908 00000 н. 0000230971 00000 п. 0000231140 00000 н. 0000231324 00000 н. 0000231501 00000 н. 0000231675 00000 н. 0000231853 00000 н. 0000232029 00000 н. 0000232089 00000 н. 0000232257 00000 н. 0000232448 00000 н. 0000232628 00000 н. 0000232815 00000 н. 0000232992 00000 н. 0000233186 00000 п. 0000233363 00000 п. 0000233543 00000 н. 0000233717 00000 н. 0000014376 00000 п. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 844 0 obj> поток xVoL [U? Q4PMh7a% J # MK1n.L3 ؅` & Yfl, -f7Q4H [> dcBd_C1 [bBcs} m1F} =?

.

No related posts.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *